清肠化湿方对HT-29细胞IL-6/JAK2/STAT3的影响

赵青春，沈　洪，程海波，朱　磊，李沐涵

(1.南京中医药大学第一临床医学院，江苏南京　210046;2.江苏省中医院消化内科，江苏南京　210029)

Effect of Qingchang Huashi Recipe on IL-6/JAK2/STAT3 pathway in HT-29 cells>

ZHAO Qing-chun1，SHEN Hong2，CHENG Hai-bo1，ZHU Lei2，LI Mu-han1(1.the First Clinical Medical School，Nanjing University of Chinese Medicine，Nanjing 210046，China;2.Dept of Gastroenterology，Jiangsu Provincial Hospital of Traditional Chinese Medicine，Nanjing 210029，China)



清肠化湿方对HT-29细胞IL-6/JAK2/STAT3的影响

赵青春1，沈洪2，程海波1，朱磊2，李沐涵1

(1.南京中医药大学第一临床医学院，江苏南京210046;2.江苏省中医院消化内科，江苏南京210029)

Effect of Qingchang Huashi Recipe on IL-6/JAK2/STAT3 pathway in HT-29 cells>

ZHAO Qing-chun1，SHEN Hong2，CHENG Hai-bo1，ZHU Lei2，LI Mu-han1
(1.the First Clinical Medical School，Nanjing University of Chinese Medicine，Nanjing 210046，China;2.Dept of Gastroenterology，Jiangsu Provincial Hospital of Traditional Chinese Medicine，Nanjing 210029，China)

关键词:清肠化湿方;溃疡性结肠炎; HT-29; IL-6; JAK2; STAT3

Key words:Qingchang Huashi Recipe; ulcerative colitis; HT-29; IL-6; JAK2; STAT3

沈洪(1959－)，男，博士，教授，主任医师，博士生导师，研究方向:消化道疾病，通讯作者，E-mail: shenhong999@ 163.com

溃疡性结肠炎(ulcerative colitis，UC)是一种反复发作的肠道慢性非特异性炎症性疾病，发病机制尚未明确，细胞因子IL-6及其介导的信号通路在非可控性肠道炎症过程中起关键作用［1］。导师沈洪教授所拟清肠化湿方(QHR)，治疗轻、中度UC，取得良好效果［2］。课题组前期研究表明该方能调控UC大鼠NF-κB/COX-2通路、PPAR-γ/NF-κB及Toll通路，减少IL-1β、TNF-α等促炎因子分泌，促进抑炎因子IL-10分泌等。本实验在此基础上，以TNF-α、LPS共刺激诱导HT-29细胞炎症模型，观察清肠化湿方对IL-6及其主要信号转导通路之一JAK2/STAT3的影响，进一步探讨其作用机制。

1　材料与方法

1.1实验材料HT-29，购自中国科学院细胞库。清肠化湿方(黄连、黄芩、煨木香等购自江苏省医药公司，生产批号20121201)。柳氨磺胺吡啶(Sulfasalazine，SASP)、McCoy's5a培养基、LPS: Sigma公司;胎牛血清(Gibco公司) ; Recombinant Human TNF-α(Pepro Tech公司)。人IL-6 ELISA试剂盒(EB公司) ;引物由上海生工合成; Real Time PCR试剂盒(TaKaRa公司) ;兔抗p-JAK2、p-STAT3单抗(Cell Signaling Technology公司)。酶标仪、电泳仪、转膜仪、Western blot曝光仪购自美国Bio-Rad公司; Real Time PCR仪(TaKaRa) ; UVP凝胶成像系统(UVP公司)。

1.2清肠化湿方水煎剂制备称取清肠化湿方1付，共87 g，煎煮、蒸发、减压浓缩至27 ml母液，4℃保存。

1.3实验分组取指数生长期HT-29细胞，分?为6组:对照组:加入不含FBS的McCoy's 5a孵育24 h;模型组:根据前期研究［3］，予hTNF-α(20 μg·L－1)［4－5］孵育12 h后，再予LPS(1 mg·L－1)［5－6］孵育15 h;实验组:根据前期研究［3］，在上述药物干预的基础上，分别加入SASP(2 mmol·L－1)、QHR高、中、低剂量(10、1、0.1 mg·L－1)孵育24 h。

1.4ELISA法检测HT-29细胞上清IL-6水平收集细胞上清液，转移至1.5 mL Eppnedorf管，离心机1 600 r·min－1离心5 min，取上清。按ELISA试剂盒步骤检测IL-6的水平。

1.5Real Time PCR法检测HT-29细胞JAK2、STAT3 mRNA相对表达水平取HT-29细胞，TRIzol充分裂解，氯仿萃取，异丙醇沉淀，75%乙醇洗涤，溶于DEPC水，－80℃保存。取2μg总RNA逆转录为cDNA。引物: JAK2:上游5'-GGAATGGCCTGCCTTACAATG-3';下游5'-TGGCTCTATC TGCTTCACAGAAT-3'; STAT3:上游5'-CACCTTGGATTGAG AGTCAAGAC-3';下游5'-AGGAATCGGCTATATTGCTGGT-3'; GAPDH:上游5'-AGGTCGGTGTGAACGGATTTG-3';下游5'-GGGGTCGTTGATGGCAACA-3'。Real-time PCR反应体系: SYBR Premix Ex Taq(2×) 12.5 μL，上下游引物各0.5 μL，cDNA模板1 μL，DEPC水9.5 μL。反应条件: 95℃预变性2 min，95℃5 s，57℃30 s，扩增45个循环; 95℃15 s，60℃30 s，95℃15 s循环读取溶解曲线，57℃30 s读取荧光。结果以CT值表示。

基因表达量以各样基因CT值减去内参基因GAPDH CT值表示，相对表达量以2－ΔΔCt表示。

1.6Western blot法检测HT-29细胞p-JAK2、p-STAT3蛋白表达取HT-29细胞，低温提取细胞总蛋白，BCA法测定蛋白浓度，以30 μg质量体积分数上样，分离胶SDS-PAGE分离样品，转膜，封闭。按1∶1 000浓度稀释一抗，4℃摇床振荡孵育过夜，充分洗涤，按1∶3 000浓度稀释二抗，室温摇床振荡孵育2 h，充分洗涤，加ECL显影液。

1.7统计学分析实验数据采用SPSS 19.0统计软件进行t检验、One way-ANOVA分析，计量资料以±s表示。

2　结果

2.1HT-29细胞上清IL-6水平模型组细胞上清IL-6水平较对照组明显升高(P＜0.01)，QHR各剂量组IL-6的水平较模型组降低(P＜0.01)，并呈剂量依赖性，QHR高剂量组与SASP组相比差异无统计学意义。见Tab 1。

Tab 1 Effects of QHR on IL-6 secretion from HT-29 cells(珋±s，n=3)

Tab 1 Effects of QHR on IL-6 secretion from HT-29 cells(珋±s，n=3)

＊＊P＜0.01 vs model

Group　IL-6/ng·L－1Control　13.07±1.43＊＊Model　98.01±2.35 SASP　32.21±1.30＊＊QHR high dose　34.60±2.22＊＊QHR middle dose　58.81±0.63＊＊QHR low dose　82.01±1.04＊＊

2.2HT-29细胞JAK2、STAT3 mRNA相对表达水平与对照组比较，各组JAK2基因表达差异倍数未见明显差异，各组STAT3基因表达差异倍数未见明显差异。

2.3HT-29细胞p-JAK2、p-STAT3蛋白表达与对照组相比，模型组p-JAK2表达明显升高(P＜0.01)，与模型组相比，各药物组明显降低(P＜0.01)，其中QHR各剂量组呈剂量依赖性。与对照组相比，模型组p-STAT3表达明显升高(P＜0.01)，与模型组相比，各药物组明显降低(P＜0.01)，其中QHR各剂量组呈剂量依赖性。见Tab 2。

Tab 2 Effects of QHR on p-JAK2，p-STAT3 protein expression in HT-29 cells(珋±s，n=3)

Tab 2 Effects of QHR on p-JAK2，p-STAT3 protein expression in HT-29 cells(珋±s，n=3)

＊＊P＜0.01 vs model

Group　p-JAK2/β-actin　p-STAT3/β-actin Control　0.09±0.005＊＊　0.1±0.011＊＊Model　0.573±0.006　1.125±0.002 SASP　0.228±0.006＊＊　0.313±0.01＊＊QHR high dose　0.234±0.008＊＊　0.266±0.008＊＊QHR middle dose　0.357±0.007＊＊　0.44±0.006＊＊QHR low dose　0.42±0.005＊＊　0.764±0.003＊＊

3　讨论

生理状态下，肠上皮细胞持续暴露于肠道共生菌并能维持稳态，在炎性因子如TNF-α等作用下，肠上皮功能破坏，免疫反应失衡，导致UC发病。研究表明，在遗传易感性IBD动物模型中Th1细胞因子和共生菌为诱导慢性炎症所必须［6］。由于体外原代培养结肠上皮细胞的困难，目前，主要使用结肠癌细胞株进行研究。Abreu等［4］研究亦表明，HT-29细胞经TNF-α刺激后可增强对LPS的反应性，LPS信号能激活胞内多条信号通路，促进大量细胞因子和粘附分子等表达，引起瀑布式的炎症级联反应［7］。本实验以前期研究为基础［3］，以LPS与TNF-α联合诱导HT-29细胞炎症，结果上清中IL-6水平明显增高，与Jeong等［5］报道一致。IL-6是一种多向性细胞因子，由活化的巨噬细胞、淋巴细胞及上皮细胞分泌，能刺激巨噬细胞或单核细胞、淋巴细胞等合成前列腺素、细胞因子、血小板激活因子等炎性介质。IL-6与受体结合后优先激活JAK和STAT3，STAT3经磷酸化活化入核，调控下游靶基因转录，参与调节炎症。IBD患者及一些动物结肠炎或肠炎模型中，皆观察到升高的IL-6［8］，高水平磷酸化的STAT3与疾病严重程度相关［9］。本实验表明清肠化湿方能降低LPS与TNF-α诱导的HT-29细胞IL-6的分泌，下调p-JAK2、p-STAT3水平，对JAK2、STAT3 mRNA表达水平无明显影响，表明清肠化湿方能抑制LPS与TNF-α诱导的HT-29细胞JAK2、STAT3的活化。清肠化湿方通过降低IL-6表达，抑制JAK2、STAT3活化，阻断炎症的发展和持续，可能是其治疗UC作用机制之一。

参考文献:

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作者简介:赵青春(1985－)，女，博士生，主治中医师，研究方向:中医内科消化系统疾病，E-mail: zqctim@163.com;

基金项目:国家自然科学基金资助项目(No 81403344，81373606) ;国家中医药行业科研专项资助(No 201407001) ;国家中医药管理局项目(No JDZX2012079) ;江苏省临床医学科技专项项目资助(No BL2014100) ;江苏高校优势学科建设工程资助项目(PAPD) ;国家中医临床研究基地(脾胃)资助项目

收稿日期:2015－02－15，修回日期:2015－04－26

文献标志码:A

文章编号:1001－1978(2015) 06－0883－03中国图书分类号: R287; R329.25; R392.12; R574.621

doi:10.3969/j.issn.1001－1978.2015.06.029