8-异丙胺亚甲基橙皮素(IPHP)在Caco-2细胞模型上跨膜转运的研究

胡婷婷，黄　成，孟晓明，陈昭琳，沈陈林，李　俊

(安徽医科大学药学院，安徽天然药物活性研究省级实验室，安徽省创新药物产业共性研究院，安徽合肥　230032)



8-异丙胺亚甲基橙皮素(IPHP)在Caco-2细胞模型上跨膜转运的研究

胡婷婷，黄成，孟晓明，陈昭琳，沈陈林，李俊

(安徽医科大学药学院，安徽天然药物活性研究省级实验室，安徽省创新药物产业共性研究院，安徽合肥230032)

摘要:目的利用Caco-2细胞模型研究8-异丙胺亚甲基橙皮素(IPHP)在小肠吸收转运的机制。方法在Caco-2细胞模型上进行IPHP的跨膜转运实验，探讨药物浓度、pH、温度、P-gp抑制剂维拉帕米、MRP2抑制剂MK-571和丙磺舒对IPHP在体外细胞模型上跨膜转运的影响。结果IPHP在Caco-2细胞模型上的转运具有一定的浓度依赖性，IPHP不同浓度从A侧到B侧的渗透系数P(app)(AP-BL) (×10(－5))分别为: (2.21±0.200)、(3.56±0.306)、(3.81±0.179)、(4.23±0.229)、(4.17±0.262) cm·s(－1)，B侧到A侧的渗透系数P(app)(BL-AP) (×10(－5))分别为: (3.57±0.209)、(4.51±0.113)、(4.97±0.229)、(5.24±0.550)、(5.07± 0.557) cm·s(－1)，外排率分别为:1.61、1.26、1.3、1.23、1.21。温度和pH对其转运均有影响，而P-gp抑制剂对于IPHP的转运没有明显的影响，MRP2抑制剂在一定程度上增加了IPHP的转运量(P＜0.05)。结论IPHP在Caco-2细胞模型上的转运方式主要是被动扩散，且其转运不受P-gp外排蛋白影响，而外排蛋白MRP2可能参与了IPHP的外排转运。

关键词:IPHP; Caco-2细胞;吸收;外排;渗透系数;被动扩散;高效液相色谱

橙皮素(hesperetin)为芸香科植物柑橘属植物果实提取物，是广泛存在于柚子和橙子中二氢黄酮类化合物，具有广泛的药理学特性，包括抗炎、抗氧化、抗肿瘤形成与生长等活性［1－3］。橙皮素口服以后生物利用度较好，但是半衰期较短，口服给药以后体内消除较快，为了维持有效血药浓度，需要频繁给药，这一缺点限制了其在临床上的应用［4］。为了克服这一缺点，本课题组通过化学合成的方法，合成了一系列的橙皮素衍生物并对其药理活性进行了筛选。本课题组前期研究发现，7，3'-二甲氧基橙皮素(7，3' -dimethoxy hesperetin，DMHP)具有较强抗炎活性，对AA大鼠继发性炎症具有良好的治疗作用［5－7］。前期研究还发现8-异丙胺亚甲基橙皮素(IPHP，见Fig1)，在体外具有良好的抗炎活性，对于由LPS刺激RAW264.7细胞产生的TNF-α和IL-6具有明显的抑制作用。该实验利用Caco-2细胞模型来模拟小肠上皮细胞对IPHP的吸收情况，通过对Caco-2细胞膜上转运蛋白，如P糖蛋白(P-gp)、多药耐药蛋白(MRP2)的研究来探讨其吸收及外排机制，为之后的药理学研究提供依据，为新型药物单体的合成提供信息指导，为将来的临床前研究提供资料。

3'，5，7-trihydroxy-8-isopropylaminomethyl-4'-methoxyflavanone (IPHP)Fig 1 Structure of IPHP

1　材料与方法

1.1细胞、药品与试剂Caco-2细胞株购于武汉博士德公司，传代数为30代; IMDM(博士德公司，批号: 04D24C59)，胰蛋白酶(博士德公司，批号: 03C28C15) ; DMSO，美国Gibco公司; Hanks液(碧云天) ; IPHP(本实验室合成，纯度＞95%) ;橙皮素对照品(西安小草植物科技有限责任公司，纯度＞98%，批号: XC1009018) ;橙皮苷标准品(中国药品生物制品检定所，纯度＞98%，批号: 110721-200613) ; MK-571和丙磺舒(美国Sigma公司) ;维拉帕米(NICPBP，批号: 100223200102) ;甲醇为色谱纯;水为双蒸水，其余所有试剂为分析纯。

1.2仪器LC-20A四元低压梯度液相色谱仪(日本岛津公司) ; XW-80A微型旋涡混合仪(上海沪西分析仪器厂有限公司) ; Neofuge23R台式高速冷冻离心机(力康发展有限公司) ; DZE-6050型真空干燥箱(上海新苗医疗器械制造有限公司) ; SHA-C水浴恒温振荡箱器(江苏金坛亿通电子有限公司) ;酶标仪，荷兰雷勃公司产品;悬挂式培养皿(Millicell-CPI) ; DDs-12A数字电导仪(Millicell-ERS) (美国Millipore公司) ; SW-CJ-IF型超净台，江苏苏净集团苏州安泰空气技术有限公司产品; NAPCO-6100型细胞培养箱，美国SHELLAB公司产品;高速离心机(珠海黑马公司)。

1.3Caco-2细胞培养及其单层的制备Caco-2细胞接种在12孔Millicell-CPI培养板上(底面积: 1.13 cm2，微孔: 3 μm)，种植密度为1×105cells· cm－2，在A侧和B侧分别加0.6 mL及1.2 mL的培养基放入37℃孵箱中孵育。每隔1天换1次液，培养约3周达到汇合、分化形成单细胞层。Caco-2细胞生长、汇合、分化在Millicell CPI膜上，细胞单层的紧密性与完整性是药物转运实验的基础。用显微镜下观察细胞的生长形态，同时每次换液时需要用DDs-12A数字电导仪测量跨膜电阻值(transepithelial electrical resistance，TEER)，当TEER＞350 Ω ·cm2时细胞可用于实验。

1.4MTT实验Caco-2细胞按照一定的密度接种于96孔板中，放入37℃孵箱中培养24 h后，弃去培养基，分别加入IPHP浓度为7.5、15、30、60、120、240、480 μmol·L－1的200 μL的培养液，37℃孵育24 h后，每孔再加入20 μL MTT溶液(5 g·L－1，即0.5% MTT)，继续培养4 h，终止培养，小心吸去孔内培养液。每孔加入150 μL DMSO，置摇床上低速振荡10 min，使结晶物充分溶解。在酶联免疫检测仪490 nm处测量各孔的吸光值(A)，计算细胞存活率(IC) : IC/%=(试验组A均值－调零空A均值)/(对照组A均值－调零空A均值)×100%。选取细胞存活率在80%以上的药物浓度作为实验所需的安全浓度。

1.5转运实验Caco-2细胞在Millicell-CPI培养板上形成紧密完整的单细胞层后，各孔贴侧壁加入37℃的Hanks液，荡洗细胞3次。吸干各孔内Hanks液，在不破坏单细胞的基础上祛除细胞表面的杂质，之后用Hanks液于37℃孵育30 min。将IPHP溶于DMSO制备成240 mmol·L－1的溶液，用Hanks液稀释至7.5、15、30、60、120 μmol·L－1的IPHP溶液。其中DMSO的浓度小于0.1%将不会影响单细胞层的完整性。孵育结束以后，在单层细胞膜内的一侧加入含药Hanks溶液，另一侧加入空白Hanks液，空白对照孔在两侧均加Hanks液。当研究药物分子从A侧向B侧方向转运时，A侧加0.6 mL含IPHP的Hanks转运液，B侧加入1.2 mL Hanks液，当研究药物分子从B侧向A侧方向转运时，A侧加0.6 mL Hanks液，B侧加1.2 mL含IPHP的Hanks液，分别于0、30、60、90和120 min时从A侧及B侧取转运液置于1.5 mL离心管中，放入－20℃冰箱中保存待测。为了探究pH对于IPHP转运吸收的影响，将含IPHP(120 μmol·L－1)的Hanks液分别在pH 5.5或pH 9.0条件下进行吸收转运实验。实验过程同上所述。探究温度是否对IPHP的吸收有影响，将含IPHP (120 μmol·L－1)的Hanks分别在4℃和37℃情况下按上述实验方法进行。

IPHP在Caco-2细胞的吸收转运是否涉及到某些转运蛋白的介导，需要我们进一步研究。将P-gp抑制剂维拉帕米(50 μmol·L－1)，MRP2抑制剂MK-571(50 μmol·L－1)和丙磺舒(1 mmol·L－1)分别溶于Hanks液中。转运实验之前，将Caco-2细胞单层模型用含有抑制剂的Hanks液于37℃孵育30 min，之后按照上述实验方法进行转运实验。

1.6样品分析本实验采用高效液相色谱法分析样品，色谱柱: Phenomenex Luna C18柱(4.6 mm× 250 mm，5 μm) ;流动相:乙腈－0.5%甲酸梯度洗脱(0～5 min，76∶24; 5～15 min，76∶24～30∶70; 15～16 min，30∶70～76∶24; 16～24 min，76∶24) ;检测波长: 288 nm;流速: 1.0 mL/min;柱温: 40℃;进样量:20 μL。

Tab 1 The IC(%) value at different IPHP concentration(±s，n=5)

Tab 1 The IC(%) value at different IPHP concentration(±s，n=5)

Concentration/μmol·L－17.5　15　30　60　120　240　480 IC/%　98.74±1.21　93.32±1.22　87.52±7.21　86.51±12.23　80.30±4.58　79.26±15.53　65.26±7.14

1.7数据分析药物分子透过单细胞层的表观渗透系数:表观渗透系数计算公式为: Papp=(dQ/dt)/A×C0，其中dQ/dt是单位时间内药物的转运量(nmol·s－1)，A是聚碳酯膜的表面积，C0为供给室中待测物的初始浓度。外排率计算公式为: ER=Papp(BL－AP)/Papp(AP－BL)。所有数据以±s表示，数据采用SPSS 16.0软件进行统计学处理，组间比较采用One-Way ANOVA检验。

2　结果

2.1Caco-2细胞单层膜完整性在显微镜下观察Caco-2细胞形态学的完整性，可观察到Caco-2细胞形成致密的紧密连接，细胞融合成连续的单层。用DDS-12A数字电导仪测量跨膜电阻(transepithelial electrical resistance，TEER)，检测到TEER均大于350 Ω·cm2。实验结果说明Caco-2细胞已经形成了完整的单细胞层，可以用于药物跨膜转运实验。

2.2MTT实验结果Caco-2细胞在IPHP浓度为7.5、15、30、60、120、240、480 μmol·L－1在24 h的存活率分别为: 98.74%、93.32%、87.52%、86.51%、80.30%、79.26%、65.26%。由Tab 1结果可知，当IPHP的药物浓度小于120 μmol·L－1时，细胞的存活率大于80%。因此，本实验所采用的药物浓度低于120 μmol·L－1，此时药物对细胞的作用在安全浓度范围内。

2.3IPHP在Caco-2上的跨膜转运实验

2.3.1药物浓度对IPHP转运的影响采用高效液相色谱法检测标准品、空白Hanks液、空白Hanks加橙皮素，IPHP和内标橙皮苷、IPHP在Caco-2细胞转运样品的色谱图见Fig 2，空白Hanks不干扰测定。高效液相色谱法测定不同时间点不同浓度下单细胞层两侧培养液中IPHP的浓度，结果见Fig 3。随着药物浓度的增加，Caco-2细胞对IPHP的摄取量逐渐增加，并且外排率ER分别为: 1.61、1.26、1.30、1.23、1.21。结果见Tab 2。

Fig 2　HPLC chromatograms of standard hesperidin，IPHP and hesperitin (A)，blank Hanks (B)，blank Hanks sample spiked with hesperedin，IPHP and hesperetin (C)，Hanks sample obtained 30 min after transport of IPHP from A to B?side (D).

Fig 3 Cumulative amount-time curve of IPHP inCaco-2 cell model(A→B and B→A，±s，n=3)

Tab 2 Effect of concentration on Pappof IPHP across Caco-2 cell monolayers (±s，n=3)

Tab 2 Effect of concentration on Pappof IPHP across Caco-2 cell monolayers (±s，n=3)

Bi-directional apparent permeability coefficients (Papp) of IPHP across Caco-2 cell monolayers.

InitialPapp(APBL)Papp(BLAP)Papp(BLAP)/Compoundconcentrations→　→　→/μmol·L－1/×10－5cm·s－1/×10－5cm·s－1Papp(AP→BL) 7.5　2.21±0.200　3.57±0.209　1.61 15　3.56±0.306　4.51±0.113　1.26 IPHP　30　3.81±0.179　4.97±0.229　1.30 60　4.23±0.229　5.24±0.550　1.23 120　4.17±0.262　5.07±0.557　1.21

2.3.2pH对IPHP转运的影响pH对药物的吸收的结果如Fig 4所示，pH 5、pH 7.4和pH 9的Papp(AP－BL) (×10－5)和Papp(BL－AP) (×10－5)分别为: (1.47±0.111) cm·s－1和(1.98±0.354) cm ·s－1; (4.23±0.229) cm·s－1和(5.24±0.550) cm·s－1; (3.01±0.262) cm·s－1和(3.77± 0.412) cm·s－1。在pH 7.4的环境下药物的转运量明显大于pH 5(P＜0.01)和pH 9 (P＜0.05)。结果表明，IPHP在中性环境中吸收情况要优于在酸性和碱性条件下，这可能与IPHP的结构特点有关，其在中性环境中吸收更好。

Fig 4　Effect of pH on PappofIPHP across Caco-2 cell monolayers±s，n=3)

2.3.3温度对IPHP转运的影响温度主要影响ATP依赖性转运蛋白的活性，可能对IPHP在Caco-2细胞上的转运产生一定的影响。因此本实验将探讨IPHP在4℃和37℃温度条件下的吸收转运情况，结果见Fig 5。由实验结果可以看出，37℃条件下IPHP的Papp(AP－BL) (×10－5)和Papp(BLAP) (×10－5)分别为［4.23±0.229］cm·s－1和(5.24±0.550) cm·s－1，而4℃条件下其Papp(AP－BL) (×10－5)和Papp(BL－AP) (×10－5)分别为(3.21±0.626) cm·s－1和(4.17±0.354) cm· s－1。37℃环境下的AP到BL侧和BL到AP侧的渗透率均高于4℃环境(P＜0.05)，说明IPHP在Caco-2细胞上的转运受温度的影响，可能与相关ATP依赖性转运蛋白有关。

Fig 5 Effect of temperature on PappofIPHP across Caco-2 cell monolayers±s，n=3)

Fig 6　Effect of transporter inhibitor on Pappof IPHP across Caco-2 cell monolayers (±s，n=3)

2.3.4抑制剂对药物转运的影响我们为了探讨转运蛋白的作用，加入了一系列的转运蛋白抑制剂，如P-gp抑制剂维拉帕米、MRP2抑制剂MK-571和丙磺舒，来观察转运蛋?白对IPHP吸收转运的影响，结果见Fig 6。实验结果表明，当加?入P-gp抑制剂维拉帕米时，药物渗透系数Papp(AP－BL) (× 10－5)和Papp(BL－AP) (×10－5)为(4.33±0.79) cm·s－1和(5.32±0.94) cm·s－1，相较于正常细胞组未发生明显变化(P＞0.05)。而加入MRP2抑制剂MK-571和丙磺舒的组药物渗透率Papp(APBL) (×10－5)和Papp(BL－AP) (×10－5)分别为(5.87±0.96) cm·s－1和(3.97±1.12) cm·s－1; (5.45±1.82) cm·s－1和(3.79±0.87) cm· s－1，由实验数据可以看出，Papp(BL－AP) (×10－5)值均比Papp(AP－BL) (×10－5)值大，且相较于正常组，外排量明显降低(P＜0.05)，吸收量明显增加(P＜0.05)。说明加入抑制剂后，某些转运蛋白受到了一定程度的抑制，导致外排量下降，吸收量增加。实验结果表明IPHP在Caco-2细胞上的转运可能与MRP2有关，而与P-gp无关。

3　讨论

Caco-2细胞是人克隆结肠腺癌细胞，在适宜的培养条件下，将Caco-2细胞种在多孔的可渗透性聚碳酸酯膜上，经过21 d的融合分化可形成连续的单层。Caco-2细胞与人小肠上皮细胞在形态学上相似，具有相同的细胞极性和紧密连接;此外，Caco-2细胞含有与小肠刷状缘上皮相似的转运系统，例如外排蛋白P-gp、MRP2等［8－11］。因此，Caco-2细胞被广泛应用于药物的跨膜转运实验，用以预测药物在人小肠的吸收的情况，较之体内的动物实验具有简单、方便、经济等特点，更适合于药物的高通量筛选。

本实验采用Caco-2单层细胞模型，模拟IPHP在肠道的吸收情况，探讨IPHP在肠道吸收的机制。MTT实验筛选出合适的用于转运的药物浓度，在安全浓度范围内进行转运实验，研究发现，IPHP在Caco-2细胞上的转运具有浓度依赖性，且随着浓度的增加其转运量逐渐增加，说明IPHP的吸收可能以被动转运为主。IPHP不同浓度从A侧到B侧的渗透系数Papp(AP－BL) (×10－5)分别为: (2.21± 0.200) cm·s－1，(3.56±0.306) cm·s－1，(3.81± 0.179) cm·s－1，(4.23±0.229) cm·s－1，(4.17± 0.262) cm·s－1，B侧到A侧的渗透系数Papp(BLAP) (×10－5)分别为: (3.57±0.209) cm·s－1，(4.51±0.113) cm·s－1，(4.97±0.229) cm·s－1，(5.24±0.550) cm·s－1，(5.07±0.557) cm·s－1，外排率分别为:1.61，1.26，1.30，1.23，1.21。在Caco-2细胞模型中药物分子的表观渗透系数与口服吸收相关联。有文献报道［12－13］，当药物的表观渗透系数大于1×10－6cm·s－1时，其表现出良好的吸收性。吸收较好药物的表观渗透系数在0.1～1× 10－6cm·s－1，而吸收差的药物，其表观渗透系数小于1×10－7cm·s－1。实验结果表明，药物IPHP的吸收良好，ER在0.5～1.5之间，差异不大，进一步说明IPHP的转运方式主要是被动转运。pH 7.4条件下IPHP的转运量高于pH 5.0和pH 9.0，说明药物在中性环境中的更容易被吸收，这可能与药物IPHP的中性结构特点有关，IPHP结构中4位羰基与5位羟基易形成氢键，7位羟基和氨基容易形成氢键，3'位羟基与甲氧基的氧在空间结构上也容易形成5元环氢键，这些氢键都是分子内氢键，同时5，6元环比较稳定，使得分子趋于稳定，从而可能表现出中性的性质。药物在中性状态下溶解更加，更容易被吸收。IPHP在4℃时的转运量相较于37℃明显减少，说明温度对IPHP的吸收是有影响的，可能与相关ATP依赖性转运蛋白有关。加入了P-gp抑制剂维拉帕米后，IPHP的转运量相较于正常组并无明显差异，说明P-gp并未参与IPHP的转运，而加入了MRP2抑制剂MK-571和丙磺舒的两组，Papp(BL－AP)值相较于正常组明显降低，Papp(APBL)值明显增加。说明MRP2可能参与了IPHP在Caco-2细胞上的转运，但是MK-571和丙磺舒并非专一性的MRP2抑制剂，其对BCRP等外排蛋白也有抑制作用，因此我们认为MRP2可能参与了IPHP的外排。

综上所述，IPHP在Caco-2细胞模型上以被动转运的吸收方式为主，同时可能有MRP2等相关外排蛋白介导其转运，且具有较好的吸收特性。

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Transportation of 8-isopropylaminomethyl hesperitin(IPHP) across human intestinal epithelial by using Caco-2 cells

HU Ting-ting，HUANG Cheng，MENG Xiao-ming，CHEN Zhao-lin，SHEN Chen-lin，LI Jun
(School of Pharmacy，Anhui Key Laboratory of Bioactivity of Natural Products，Anhui Institute of Innovative Drugs，Anhui Medical University，Hefei 230032，China)

Abstract:AimTo study the mechanism of 8-isopropylaminomethyl hesperitin (IPHP) intestinal absorption using Caco-2 cell lines.Methods Using Caco-2 cell lines as an intestinal epithelial cell model，the effects of drug concentration，temperature，pH，P-glycoprotein (P-gp) inhibitor verapamil and multidrug resistance protein 2 (MRP2) inhibitors MK-571 or probenecid on IPHP transport across Caco-2 cell lines were all investigated.ResultsThe transportation of IPHP was related to drug concentration.The P(app)(APBL) (×10(－5)) was (2.21±0.200) cm·s(－1)，(3.56 ±0.306) cm·s(－1)，(3.81±0.179) cm·s(－1)，(4.23 ±0.229) cm·s(－1)，(4.17±0.262) cm·s(－1)，respectively，and P(app)(BL-AP) (×10(－5)) was (3.57± 0.209) cm·s(－1)，(4.51±0.113) cm·s(－1)，(4.97± 0.229) cm·s(－1)，(5.24±0.550) cm·s(－1)，(5.07± 0.557) cm·s(－1)，respectively.Efflux rate was 1.61，1.26，1.3，1.23，1.21，respectively.Temperature and pH both influenced the transport，While the P-gp inhibitor verapamil had no effect on the transport of IPHP.MRP2 inhibitors MK-571 or probenecid led to an apparent decrease in the efflux of IPHP.ConclusionThe results suggest that the transport of IPHP is mainly passive diffusion，and MRP2 but not P-gp may be involved in the transport of IPHP.

Key words:IPHP; Caco-2 cell; intestinal absorption; efflux; apparent permeability coefficients; passive diffusion;HPLC

作者简介:胡婷婷(1988－)，女，硕士生，研究方向:生物药剂学，E-mail: anhuihtt@ 163.com;李俊(1960－)，男，博士，教授，博士生导师，研究方向:临床药理学、抗炎免疫药理学、药代动力学，E-mail: lj@ ahmu.edu.cn

基金项目:国家自然科学基金资助项目(No 81273526) ;安徽省科技攻关项目(No 1301042212) ;安徽省自然科学基金资助项目(No 1206c0805026) ;安徽医科大学博士科研启动基金(No XJ201118)

收稿日期:2015－01－19，修回日期:2015－03－20

文献标志码:A

文章编号:1001－1978(2015) 06－0769－06中国图书分类号: R284.1; R322.45; R329.24

doi:10.3969/j.issn.1001－1978.2015.06.007