MKK4蛋白在骨肉瘤中表达的意义

袁海洪

摘要：目的 探讨检测丝裂原活化蛋白激酶激酶-4（MKK4）在骨肉瘤中的表达、发生发展及其预后的关系。方法 选取我院骨肉瘤标本28例，应用免疫组化SP法检测其MKK4的表达。结果 在骨肉瘤细胞核和细胞质中MKK4的表达明显，MKK4在骨肉瘤细胞质的表达与临床分期成正相关（r=0.72， P=0.000），MKK4在有转移的骨肉瘤细胞质中的表达明显高于无转移的骨肉瘤（P<0.05），而在细胞核中无明显差异， 细胞核中MKK4表达的阳性率与骨肉瘤与临床分期无相关性。结论 MKK4对骨肉瘤的发生发展可能有促进作用，MKK4与骨肉瘤的转移及预后有关，可作为一个潜在的判断骨肉瘤预后的一种指标。

关键词：MKK4； 骨肉瘤；表达

MAPK具有传导增殖信号和凋亡信号的功能，其信号转导通路在调控细胞分裂、增殖和凋亡过程起着重要的作用，是目前人们认识的最重要的细胞分裂调节系统，人们也越加关注对MAPK通路与肿瘤调控关系。唯一能同时磷酸化并激活MAPK通路中的P38/MAPK通路和JNK/MAPK通路的激酶是丝裂原活化蛋白激酶激酶-4（MKK4）[1，2]，以往的大量研究证实了在肿瘤的形成及发展过程中，MKK4 扮演着复杂的角色。研究表明大肠癌、乳腺癌等肿瘤中MKK4表达均有异常，但其在骨肉瘤中的表达情况尚不清楚。本文收集我院2001年1月～2012年12月28例骨肉瘤标本，利用免疫组织化学技术检测骨肉瘤标本中MKK4蛋白的表达，探讨MKK4与骨肉瘤发生发展及其预后的关系，报道如下：

1 资料与方法

1.1一般资料 收集我院2001年1月～2012年12月28例骨肉瘤标本，均经病理确诊，男18例，女10例，年龄9～52岁，平均年龄20.09岁；28例标本经10%福尔马林固定后，Rapid·Immuno脱钙液脱钙，常规石蜡包埋。

1.2 方法 应用链霉菌素-生物素（SP）免疫组化技术分别检测骨肉瘤组织中MKK4的表达，阳性对照用已知阳性切片，用PBS代替一抗作阴性对照，操作步骤均按试剂盒说明书进行。Rapid·Immuno脱钙剂为福州迈新生物技术公司产品，Mkk4兔单克隆抗体试剂为美国Epitomics公司产品。

1.3 结果判定 MKK4蛋白表达以细胞核和/或细胞浆出现黄色或棕黄色染色为阳性细胞。每张切片随机选取5个高倍镜视野进行阳性细胞计数。着色强度分为4级：3级为棕褐色，2级为棕黄色，1级为浅黄色和黄色，O级为无色；阳性细胞比例分为5级：阳性细胞比例>80%为4，阳性细胞比例51～80%为3，阳性细胞比例11%～50%为2，阳性细胞比例≤10%为1，无阳性细胞为0。采用IRS评分法[3]对切片进行免疫组织化学评分，即阳性细胞比例（PP）与染色深度（SI）的乘积（IRS=PP×SI）。两项合计乘积阴性为0～3，弱阳性为4～6，中等阳性为8，强阳性为9～12。

1.4 统计学处理 对数据进行分析处理用的是SPSS17.0统计学分析软件。对实验数据进行方差分析及χ2检验，差异有统计学意义P<0.05。

2 结果

可见异型细胞散在分布在HE染色后的肉瘤组织切片中，并可见由肉瘤细胞直接产生的骨样组织分布细胞周围，出现不典型核分裂相（见图1），MKK4蛋白主要表达于细胞质和细胞核，呈棕黄色或棕褐色，细胞核的染色更深（见图2）。

骨肉瘤不同临床分期细胞质中MKK4的表达有明显差异（χ2=18.18， P=0.001），且与临床分期呈正相关（r=0.72， P=0.000）；细胞核中MKK4表达的阳性率与骨肉瘤不同临床分期无明显差异（χ2=4.17， P=0.20），且与临床分期无相关性（P=0.08）。MKK4在初诊转移、初诊未转移及术后转移骨肉瘤中的表达有显著差异（χ2=9.69， P=0.033）；在三者细胞核中表达无明显差异（χ2=1.00， P=1.00）。

对骨肉瘤患者进行logistic分析，提示临床分期（OR=3.22，P=0.08）、MKK4 在细胞质中高表达（OR=3.01，P=0.12）为骨肉瘤转移或复发的危险因素。（见表1）

3 讨论

骨肉瘤发病率占骨原发性恶性肿瘤第一位，它的发生涉及到多基因的调控和细胞信号的转导。丝裂活化蛋白激酶（MAPK）能将细胞外信号转导到细胞内的重要信号转导系统，在调控细胞增殖、分裂和凋亡过程中有重要的作用。MKK4是唯一能磷酸化并激活MAPK中的P38通路和JNK通路的激酶，作为MAPK信号转导通路的重要上游激酶，参与到细胞的增殖、分化、衰老等过程，从而在肿瘤的发生、发展等过程中起到调控作用[4]。

目前，尚不明确MKK4是抑癌基因还是原癌基因。部分研究显示， MKK4 为抑癌基因， 具有肿瘤抑制作用[5]。但也有研究指出MKK4为癌基因，具有致肿瘤作用[6]。 本实验应用免疫组织化学技术检测骨肉瘤中MAPK上游激酶MKK4蛋白的表达情况，发现MKK4在骨肉瘤组织的细胞核及细胞质中均有明显表达，骨肉瘤不同临床分期细胞质中MKK4的表达有明显差异，且与临床分期呈正相关；细胞核中MKK4表达的阳性率与骨肉瘤不同临床分期无明显差异，且与临床分期无相关性。证明了MKK4在骨肉瘤的发生、发展中起一定的促进作用，MKK4表达越多，下游底物活化越多，且与肿瘤恶性程度相关。MKK4在初诊转移、初诊未转移及术后转移骨肉瘤中的表达：MKK4在三者细胞质中的表达有显著差异；在三者细胞核中表达无明显差异，MKK4在初诊转移骨肉瘤组织细胞质中的表达高于初诊无转移的，而细胞核中的表达情况无明显差异，提示骨肉瘤细胞质中MKK4高表达可能与骨肉瘤转移有关，可作为一个潜在的判断骨肉瘤预后的指标之一。本实验提示MKK4在骨肉瘤的发生发展中有促进作用，且与骨肉瘤的预后有关，可能为原癌基因。

到目前为止， MKK4尚不能被定义为一个单纯的原癌基因或抑癌基因，其与肿瘤关系还存在争议， 这需我们对其更进一步深入研究。

参考文献：

[1]Derijard B， Raingeaud J， Barrett T， Wu IH， Han J， Ulevitch RJ， Davis RJ： Independent human MAP-kinase signal transduction pathways defined by MEK and .

[2]郑建明 雷蔡： 细胞分裂素活化蛋白激酶在骨肉瘤中的表达及其意义[J]. 中国矫形外科杂志 2006， 14（20）：1579.

[3]Chang L， Karin M.Mammalian MAP kinase signalling cascades[J].Nature 2001，410（6824）：37-40.

[4]Whitmarsh AJ， Davis RJ： Role of mitogen-activated protein kinase kinase 4 in cancer. Oncogene，2007， 26（22）：3172-3184.

[5]Stark AM， Tongers K， Maass N，et al. Reduced metastasis-suppressorgene mRNA-expression in breast cancer brain metastases [J]. CancerRes Clin Oncol，2005，131：191-198.

[6]黄闯， 张学渊， 魏运军， 等. MKK4 基因在喉鳞癌中的表达及其临床意义[J]. 肿瘤， 2009， 29（ 9） ： 898 -901.

编辑/王海静