延龄草总皂苷对糖尿病大鼠心肌细胞凋亡的影响

王凤杰，陈显兵，张 顺，刘锦红，刘 昕

1.湖北民族学院科技学院（湖北恩施445000）

2.湖北民族学院医学院（湖北 恩施445000）

3.湖北民族学院附属民大医院（湖北恩施445000）

·论著·

延龄草总皂苷对糖尿病大鼠心肌细胞凋亡的影响

王凤杰1，2，陈显兵2∗，张 顺2，刘锦红3，刘 昕3

1.湖北民族学院科技学院（湖北恩施445000）

2.湖北民族学院医学院（湖北 恩施445000）

3.湖北民族学院附属民大医院（湖北恩施445000）

目的探讨延龄草总皂苷（Total saponins of Trillium，TST）对链脲佐菌素（streptozotocin，STZ）诱导的实验性糖尿病大鼠心肌细胞凋亡的影响。方法雄性SPF级SD大鼠50只，随机分为正常对照组、糖尿病组、延龄草总皂苷50、100、200mg／kg组（TST50，TST100，TST200），后四组采用一次性腹腔注射STZ 40mg／kg复制糖尿病模型。造模成功后正常组和糖尿病组给予同体积纯净水，其余三组分别给予延龄草总皂苷50、100、200mg／kg／d连续灌胃给药10周，实验结束处死大鼠，取心脏称重计算心脏重量指数（心重／体重）；TUNEL法计算心肌细胞凋亡指数；HE染色观察心肌结构改变；酶联免疫吸附试验（enzyme－linked immunosorbent assay，ELISA）检测血清中肿瘤坏死因子α（tumour necrosis factorα，TNF－α）、白介素－1β（interleukin－1β，IL－1β）的变化；Western blot检测凋亡相关蛋白Bcl－2、Bax、Caspase－3的表达。结果100和200mg／kg TST均可明显降低糖尿病大鼠血清中炎症因子TNF－α（P＜0.01）和IL－1β（P＜0.05）的水平，而50mg／kg TST作用不明显；不同剂量的TST均可降低糖尿病大鼠心肌组织中Bax的表达，抑制Caspase－3的活性，而100和200mg／kg TST可增强凋亡抑制蛋白Bcl－2的水平（P＜0.05）。结论延龄草总皂苷可减轻糖尿病大鼠体内炎症反应，抑制心肌细胞凋亡从而保护糖尿病心肌损伤，有一定的抗炎、抗凋亡作用。

延龄草总皂苷；糖尿病；心肌细胞凋亡；炎症因子

头顶一颗珠（trillium tschonoskiimaxim，TTM）系百合科延龄草属植物延龄草的干燥根茎（俗称地珠），其提取物中主要含有甾体皂甙、黄酮苷及倍半萜苷等有效成分［1］，称为延龄草总皂苷（Total sapo⁃nins of Trillium，TST），经研究证实其具有抗癌、抗炎、提高免疫力、改善心功能、清除自由基等功效［2］。关于延龄草总皂苷对糖尿病的作用研究很少，前期研究中我们已成功构建出糖尿病大鼠模型［3］，并且应用TTM提取液灌胃处理后，大鼠一般情况、血糖、血脂等指标得到明显改善，本文拟进一步研究TST对糖尿病大鼠心肌细胞凋亡的影响。

1 材料与方法

1.1 动物、药品与试剂实验动物：SD大鼠，雄性，SPF级，体质量150～180 g，购于湖北省实验动物研究中心，许可证号：SCXK（鄂）2015－0018。药品与试剂：TTM根状茎及根购于湖北省乐之塬科技有限公司；链脲佐菌素（streptozotocin，STZ）购于美国Sig⁃ma公司；BCA法蛋白定量试剂盒（上海碧云天生物技术有限公司）；TUNEL凋亡检测试剂盒购于瑞士罗氏公司；所有抗体均购自于美国Santa Cruz公司。

1.2 TST提取取TTM根状茎及根烘干粉碎，过60目筛，用石油醚浸泡3 h后，加热回流提取2 h，过滤，滤渣为脱脂粗粉；用75%乙醇浸泡数小时后回流提取，反复多次，将提取液滤过并减压浓缩、干燥，得总提取物；加水至总提取物全部溶解，用适量乙醚反复萃取多次，除去浓缩液中的脂溶性成分；脱脂后水饱和正丁醇萃取，减压浓缩干燥，得延龄草总皂苷，经测定药品总皂苷含量（18.54mg／g生药材）。

1.3 糖尿病模型及分组雄性SPF级SD大鼠50只，随机分为正常对照组、糖尿病组、不同剂量TST（mg／kg）组（TST50，TST100，TST200），每组10只，后四组给予一次性腹腔注射STZ40mg／kg复制糖尿病模型，3 d后测空腹血糖，连续2次血糖＞13.9 mmol／L，且有多饮、多食、多尿的大鼠为造模成功，用于后期实验，此时DM组和TST50组各有一只大鼠死亡，其余动物正常至实验结束。TST各组分别用延龄草总皂苷50、100、200mg／（kg·d）连续灌胃给药10周；正常组和糖尿病组给予同体积纯净水灌胃，实验结束后处死大鼠行各项指标检测。

1.4 指标检测

1.4.1 血液生化指标检测 实验结束后立即处死取血，检测血清中TNF－α和IL－1β水平；完整取出心脏，剪除包膜、大血管等，称重；计算心重指数［心脏体重指数（CWI）＝心脏质量（mg）／大鼠体质量（g）］。

1.4.2 HE染色观察心肌结构 将5mm×5mm×5 mm的左室心肌组织浸入4%多聚甲醛液中固定，常规石蜡包埋后连续切片，切片厚度约4μm，放入温水中伸展并贴片，置于60℃摊片机中烘烤1 h，石蜡切片经脱蜡等步骤后进行常规HE染色，显微镜下观察心肌的显微结构变化。

1.4.3 心肌细胞凋亡指数检测［4］采用末端脱氧核苷酸转移酶介导的原位缺口末端标记（terminal deoxynucleotidyl transferase－mediated dUTP－biotin nick end labeling，TUNEL）法：4%甲醛固定心肌组织，石蜡包埋，制成4μm厚切片，每只大鼠制作10张切片，按TUNEL试剂盒说明进行操作，应用Image－Pro Plus 6.0图像分析软件计算凋亡指数。每个标本随机选取10个高倍视野（×400），分别计数凋亡细胞核和正常细胞核，凋亡细胞核固缩，呈棕色，凋亡指数（apoptosis index，AI）为凋亡细胞核与正常细胞核比值的平均值。

1.4.4 Western blot检测Caspase3，Bax，Bcl－2表达取备用心室肌组织，用含有PSMF的裂解液在冰上裂解，加入上样缓冲液，煮沸10min，然后将总蛋白在80V条件下进行电泳，转膜，5%脱脂奶粉室温下封闭2h，加入一抗孵育4℃过夜。TBS－T洗涤3次，室温下孵育二抗2h，PBS洗膜3次每次10min，暗室加发光剂2min压片，显影，定影，水洗，以β－actin为内参照，用分子生物学图像分析系统测定各目的条带吸光度比值。

1.5 统计学分析运用SPSS 17.0统计软件，计量资料以均数±标准差（±s）表示；组间比较采用单因素方差（one－way ANOVA）分析或t检验。P＜0.05为差异有显著性。

2 结果

2.1 各组大鼠CWI及血清中TNF－α和IL－1β含量情况与正常组相比，糖尿病大鼠血清中TNF－α和IL－1β水平明显升高（P＜0.05）；100及200mg／ kgTST灌胃可分别降低TNF－α和IL－1β至（152.00 ±16.65）ng／L，（143.35±4.82）ng／L（P＜0.01）和（10.50±1.05）ng／L，（11.07±1.17）ng／L（P＜0.05）。而50mg／kg TST灌胃对IL－1β的水平无明显改变。不同剂量的TST灌胃均可降低大鼠心脏重量指数，见图1。

2.2 各组大鼠心肌组织形态学观察常规形态学观察可看出：正常组大鼠心肌纤维层次清晰、排列规则，细胞核蓝染，细胞间隙均匀，未见明显炎细胞及纤维化；糖尿病组心肌细胞排列紊乱，散在肌纤维变性、胞浆粗颗粒状，间质水肿、大量淋巴细胞浸润，部分区域可见胶原纤维增生；TST治疗后炎细胞浸润程度及细胞水肿现象明显减轻，间质内未见明显异常。见图2。

图1 各组大鼠心重指数及血清中TNF－α和IL－1β含量情况

图2 心肌组织形态学特点（HE，×400）

2.3 心肌细胞凋亡指数检测与正常组比较，糖尿病组及TST50组大鼠心肌凋亡指数明显增加（P＜0.05）；与糖尿病组相比，100和200mg／kg TST治疗可降低糖尿病大鼠心肌细胞凋亡指数（P＜0.05）。

图3 心肌细胞凋亡指数（AI%，±s）

2.4 Westernblot检测Caspase3，Bax，Bcl－2表达与正常组比较，糖尿病组凋亡抑制蛋白Bcl－2表达明显降低（P＜0.05），促凋亡蛋白Caspase3，Bax的表达增强（P＜0.05）。与糖尿病组比较，50mg／kg TST组心肌组织中Caspase3，Bax表达无明显变化（P＞0.05），Bcl－2表达明显增高（P＜0.05）；而100和200mg／kg TST组Caspase3，Bax表达降低，Bcl－2表达增强，差异有统计学意义（P＜0.05），见图4。

图4 心肌组织中Caspase3，Bax，Bcl－2表达（Western blot）

3 讨论

糖尿病心肌病发病机制复杂，心肌内炎症反应的激活是主要损伤机制之一，炎症因子及促炎细胞因子在糖尿病的发展中起重要作用，因此本研究主要从炎症反应角度探讨TST对STZ诱导的糖尿病大鼠心肌细胞凋亡的影响及其机制。TST具有一定的抗炎［1］、抗氧化［2］、抗肿瘤等作用，近年来多项研究结果表明抗氧化治疗可抑制糖尿病心肌损伤［5］，也有报道［6－7］证实糖尿病氧化应激与心肌细胞凋亡密切相关，氧化应激可以通过多种途径促进心肌细胞凋亡。TNF－α是炎症反应中较早释放的内源性介质，在细胞分化和凋亡中起重要作用［8］，并可诱导IL－1、IL－6等合成，促进免疫炎症反应进展［9］。本组结果显示糖尿病时心肌细胞凋亡率增加及血清中TNF－α、IL－1β水平明显升高，100和200mg／kgTST治疗后凋亡抑制、炎症因子浓度降低，而低浓度的TST作用不明显，有一定的剂量依赖性，证实TST在抑制心肌细胞凋亡和减少炎症因子产生方面可能与某些临床药物的效果相同，因此推测TST具有保护糖尿病心肌损伤作用。

糖尿病心肌病发生与心肌细胞凋亡有关［6－7，10］，但是糖尿病时心肌细胞凋亡机制复杂，其中caspase3是公认的凋亡转导过程中的重要因子，caspase3激活后凋亡不可避免的发生，结果显示糖尿病时心肌组织中caspase3表达增强，细胞凋亡率也增加。我们还发现糖尿病时大鼠心肌细胞肥大、排列紊乱，间质水肿、大量炎细胞浸润，可见少量纤维组织增生，另可见小血管内膜增生等，这可能是心脏扩大和心脏重量指数增大的原因，是心肌组织对糖尿病早期损伤的综合性反应。进一步研究显示糖尿病大鼠心肌组织中Bcl－2蛋白表达下降，而Bax表达增强，细胞凋亡率增加，可能是糖尿病大鼠Bcl－2／Bax调控失调，导致细胞凋亡发生进展。而且100和200mg／kg的TST治疗后可上调Bcl－2水平，降低Bax和caspase3活性表达，从而抑制细胞凋亡，改善临床症状。人参皂苷Rg1可抑制高糖所致的心肌细胞肥大［11］，而延龄草有效成分内含多种皂苷，可能是其抑制心肌细胞凋亡、保护糖尿病时心肌细胞损伤的原因；也可能是因为恩施地区延龄草有效成分中含有硒元素，增强了TST的抗炎、抗氧化作用。

总之，TST可明显抑制糖尿病大鼠体内炎症介质TNFα、IL－1β的产生，减轻心肌炎症反应；可通过促进凋亡抑制蛋白Bcl－2的表达，减弱caspase3的活性，来抑制糖尿病心肌细胞凋亡，达到预防或延缓心肌病变发生的作用。关于其具体作用机制还有待研究。

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Effects of Total Saponins of Trillium on M yocardial Cell Apoptosis in Diabetic Rats

WANG Fengjie1，2，CHEN Xianbing2∗，ZHANG Shun2，LIU Jinhong3，LIU Xin3
（1．Science and Technology College ofHubei University for Nationalities，Enshi445000，China；2．Medical School of Hubei University for Nationalities，Esnhi445000，China；3．Pathology Department in Affiliated Hospital ofHubei University for Nationalities，Esnhi445000，China）

ObjectiveTo exp lore effects of total saponins of Trillium （TST）on m yocardial cell apoptosis in experim ental diabetic rats induced by streptozocin（STZ），and further study the m echanism s of TST．MethodsFiftym ale SD rats，w ere random ly divided into norm algroup、dia⁃betes m ellitus group，50，100，200m g／kg／d of TST groups（TST50，TST100，TST200）．The later four groups w ere given STZ（40m g／kg）by intraperitoneal injection to duplicate the m odelof di⁃abetes．After experim ent，the norm al group and diabetic group w ere given the sam e volum e pure w ater，and the other three groups w ere given TSTw ith 50，100，200m g／kg／d in continuous intragastric adm inistration for 10 w eeks．Finally，the rats w ere sacrificed and calculated the car⁃diac w eight index（cardiac w eight／body w eight，CW I）；the index of m yocardial cell apoptosis w as calculated by TUNELm ethod；m yocardial changes w ere observed by Hem atoxylin and eo⁃sin（HE）staining；the level of tum or necrosis factor－alpha（TNF－α），interleukin－1 beta（IL－1β）in serum w as detected by Enzym e linked imm unosorbent assay（ELISA）；and the expres⁃sion of Bcl－2，Bax，caspase－3 related to apoptosis w ere detected by W estern blot．Results100 and 200m g／kg TST can significantly reduce the levels of inflamm atory cytokines TNF－α）（P＜0.01）and IL－1（P＜0.05）in serum of diabetic rats，and 50m g／kg TST has no obvious effect．Different dosage of TST can decrease the expression of Bax and inhibit the activity of Caspase－3，but only w ith 100 and 200m g／kg TST can enhance the expression of Bcl－2（P＜0.05），finally decrease the apoptosis rate ofm yocardial cells．ConclusionTST can protectm yocardial cells by reducing the inflamm atory response in diabetic rats and inhibiting m yocardial apoptosis，w hich has anti－inflamm ation and anti－apoptosis effects．

Total saponins of Trillium；diabetes m ellitus；m yocardial cellapoptosis；inflamm a⁃tory factor

R587.1

A

1008－8164（2015）04－0001－04

2015－08－16责任编辑：牟冬生

湖北省教育厅科学技术研究项目（B2015112）。

王凤杰（1981－），女，山东青岛人，硕士，讲师，研究方向：中药药理与糖尿病发病机制；∗

陈显兵（1976－），副教授，研究方向：生物资源的开发与利用。