狼疮性肾炎患者血浆组蛋白乙酰化酶和组蛋白去乙酰化酶表达及其与IL-6、INF-γ 的关系*

刘抗寒，梁玉梅，饶慧，欧阳沙西，刘芳，曾清华，黄安兰

（湖南省人民医院 肾脏风湿免疫科，湖南 长沙410005）

狼疮性肾炎（lupus nephritis，LN）是系统性红斑狼疮（systemic lupus，SLE）最常见的并发症和死亡原因[1]。细胞因子在LN病理进程中扮演着重要的角色，针对细胞因子的治疗也越来越受到重视。表观遗传学（epigenetics）是近年来生物医学研究的热点，它认为在基因序列不变的情况下，DNA合成后的修饰，包括DNA甲基化和组蛋白乙酰化在基因表达调控中起重要作用[2-3]。组蛋白乙酰化酶（histone acetyltransferase，HAT）、组蛋白去乙酰化酶（histone deacetylase，HDAC）是调节组蛋白乙酰化的关键酶。同卵双胞胎同患SLE一致率仅39%～60%，表观遗传学很好地解释了为什么DNA序列完全相同的个体对SLE的易感性不同[4]。HAT、HDAC在狼疮性肾炎患者中表达如何，是否参与了狼疮性肾炎的发病，目前尚无相关研究。本实验旨在研究狼疮性肾炎患者血浆中HAT、HDAC表达水平及其与狼疮肾炎活动性及白介素-6（interleukin-6，IL-6）、干扰素-γ（interferon-γ，INF-γ）的关系，探寻其在LN发病中可能的作用。

1 资料与方法

1.1 研究对象及实验分组

18例狼疮肾炎患者均为2012年07月-2014年5月本科室住院患者，全部患者都达到美国风湿学会（American College of Rheumatology，ACR）1997年推荐的SLE的分类诊断标准。参照FENG、WAGNER等学者[5-6]对LN的分类标准，满足以下条件为活动性的LN，蛋白尿>0.5 g/d，或活动性尿沉渣改变（血尿>5个红细胞/Hp，或脓尿>5个白细胞Hp，或1个细胞管型/Hp），血肌酐升高>1.2mg/dl，并排除感染、肾结石和其他原因引起的。非活动的LN：蛋白尿<0.5 g/L，非活动性的尿沉渣。将LN患者分为两组：非活动性组（inactive group，I组），患者8例，男1名，女7名，年龄26～51岁，平均（36.1±10.4）岁；活动性LN组（active group，A组），患者10例，其中，男2名，女8名，年龄24～53岁，平均（39.5±9.4）岁。正常对照组（normal group，N组），患者8例，其中，男1名，女7名，年龄23～36岁，平均（39.4±4.6）岁，均来自本院的健康医务人员。

1.2 实验方法

1.2.1 标本收集 所有研究对象均在体检时或者入院时空腹采集静脉血，静置30min后，3 000 r/min离心10min，去除下层血细胞，留取上层血清，并将其置于-80℃超低温冰箱内冻存，待标本收集完毕后检测HAT、HDAC、INF-γ 浓度。

1.2.2 采用ELISA检测血浆HAT、HDAC、INF-γ水平 血清中HAT、HDAC、IL-6、INF-γ 浓度的测定，严格按照美国RD公司提供人HAT、HDAC、IL-6、INF-γ 试剂盒内的说明书执行。

1.3 统计学方法

所有数据采用SPSS 11.5软件包进行分析，计量资料以均数±标准差（±s）表示，两个样本均数之间的比较依据资料的性质，采用方差分析（ANOVA），相关性分析采用Pearson相关性分析。检验水准为α=0.05。

2 结果

2.1 一般资料分析

本实验入组的LN患者共18例，其中，女15例，男3例，平均年龄分别为（36.1±10.4）vs（39.5±9.4）岁。正常对照组、非活动性LN组、活动性LN组组间的性别、年龄差异均无统计学意义。各组患者的一般资料见表1。

表1 LN患者及对照组的一般资料 （±s）

表1 LN患者及对照组的一般资料 （±s）

注：Pred：强的松；HCQ：羟氯喹；MMF：霉酚酸酯；CTX：环磷酰胺；ACEI/ARB：血管紧张素转换酶抑制剂或血管紧张素受体拮抗剂

组别 性别（女）/% 病程/月 蛋白尿/（g/L） 血肌酐/（μmol/L） SLEDAI 主要治疗A组（n=10） 80.0 9.1±6.4 1.89±0.61 93±52.7 8.2±2.3 Pred+HCQ+MMF/CTX+ACEI/ARB I组（n=8） 87.5 8.7±5.4 0.32±0.19 80±40.7 2.25±1.0 Pred+HCQ+MMF/CTX/ACEI/ARB N组（n=8） 87.5 - 0.02±0.01 73±33.7 0 -

2.2 各组患者血浆HAT、HDAC含量

I组患者血浆HAT含量低于N组，但差异无统计学意义[（12.54±4.94）vs（15.32±3.32），P>0.05]，A组患者HAT含量明显低于N组，差异有统计学意义[（9.74±3.67）vs（15.32±3.32），P<0.05]，但与I组患者比较，差异无统计学意义；在N组中血浆HDAC含量较高（17.08±6.46），而I组和A组患者中血浆HDAC含量明显降低[（6.75±2.05）vs（4.53±3.62）]，与正常对照组比较差异有统计学意义，但两组之间比较差异无统计学意义。见表2。

表2 各组血浆HAT、HDAC含量 （±s）

表2 各组血浆HAT、HDAC含量 （±s）

注：1）与N组比较，差异有统计学意义，P<0.05；2）与I组比较，差异有统计学意义，P<0.05

组别 HDAC/（ng/L）N组（n=8） 17.08±6.46 I组（n=8） 6.75±2.052）A组（n=10） 4.53±3.622）HAT/（ng/L）15.32±3.32 12.54±4.94 9.74±3.671）

2.3 各组患者血浆IL-6、INF-γ 含量

I组和A组患者血浆中IL-6、INF-γ 均明显高于N组，A组患者血浆中IL-6、INF-γ 明显高于I组患者，差异有统计学意义。见表3。

表3 各组血浆IL-6、INF-γ 含量 （±s）

表3 各组血浆IL-6、INF-γ 含量 （±s）

注：1）与N组比较，差异有有统计学意义，P<0.05；2）与I组比较，差异有有统计学意义，P<0.05

组别 INF-γ/（ng/L）N组（n=8） 0.48±0.26 I组（n=8） 1.66±0.581）A组（n=10） 2.86±0.851）2）IL-6/（ng/ml）90.21±13.34 123.67±23.071）174.12±30.281）2）

2.4 HAT、HDAC与IL-6、INF-γ 相关性分析

发现HAT、HDAC与IL-6呈负相关（r分别为-0.532和-0.665）；同时，HAT、HDAC与INF-γ 呈负相关（r分别为-0.621和-0.720）。

3 讨论

表观遗传学参与了SLE的发病机制[4，7-8]。组蛋白乙酰转移酶（HAT）主要是在组蛋白H3、H4的N端尾上的赖氨酸加上乙酰基，弱化组蛋白赖氨酸的正电荷，减少组蛋白与DNA之间的静电作用，增加基因的表达；组蛋白去乙酰化酶（HDAC）则相反，参与组成转录共同抑制复合物。HAT与HDAC活性改变，会导致组蛋白乙酰化程度发生改变，影响基因转录，参与炎症免疫性疾病等多种疾病的发生[2]。

本研究首次观察了狼疮性肾炎患者血浆中HAT、HDAC表达情况，并发现LN活动期患者和非活动期患者血浆HAT、HDAC较正常对照组明显降低。表明狼疮性肾炎患者HAT、HDAC活性发生了改变，可能参与了狼疮性肾炎的发病。实验结果提示，活动组患者血浆中HAT、HDAC低于非活动组患者，尽管这种差异没有统计学意义，但由于本研究样本量较少，不能简单地认为，血浆HAT、HDAC含量与LN活动性无关，这有待进一步大样本的研究。

细胞因子在SLE病理进程中扮演着重要的角色，并与LN活动性有着密切的关系[9]。IL-6可以激活B细胞，促使浆细胞分化，也能促进Th17和滤泡Th细胞分化，是一种重要的促炎症因子[10]，而INF-γ是主要由NK、CD4、CD8T细胞产生发挥免疫刺激和免疫调节作用的一个关键的细胞因子[11]。系统性红斑狼疮和狼疮性肾炎患者血浆中IL-6、INF-γ 明显高于正常水平[9]，在狼疮性肾炎患者中已经观察到高水平INF-γ 与肾脏疾病的严重程度相关，同时，血浆中INF-γ 含量升高与增殖性肾小球肾炎和膜性肾病（IV型和V型）相关[12]。活动性LN患者尿中INF-γ 表达增多，其水平与SLEDAI相关[13]。本研究中发现，LN患者血浆中IL-6、INF-γ 水平明显高于正常人，同时，活动性LN组血浆中IL-6、INF-γ 明显高于非活动组，这与其他学者的研究结果基本一致[7]，提示IL-6、INF-γ 与LN活动相关。

为了进一步探寻HAT、HDAC与LN的关系，本课题组分析了HAT、HDAC和IL-6、INF-γ 的相关性。通过相关性分析发现，HAT、HDAC与IL-6、INF-γ 呈负相关，提示血浆HAT、HDAC的改变可能影响IL-6、INF-γ 表达，间接提示HAT、HDAC可能与LN活动相关。组蛋白具有各种炎症因子和炎症信号转录的“开关”分子功能，组蛋白乙酰化改变参与多种细胞因子激活，HAT、HDAC则直接调节组蛋白乙酰化水平[14-15]。HAT、HDAC的活性改变可能直接影响细胞中IL-6、INF-γ 基因启动子组蛋白乙酰化水平发挥作用，或者通过影响其他促炎症因子基因组蛋白乙酰化水平间接增加IL-6、INF-γ 表达，其具体机制有待进一步研究。

以上研究表明，LN患者血浆HAT、HDAC活性降低，可能影响IL-6、INF-γ 等表达，可能参与LN的发病。

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