肺间质纤维化中去整合素金属蛋白酶17的表达及作用机制*

张蕾，刘敬禹，张辉

（1.辽宁医学院 生物化学与分子生物学教研室，辽宁 锦州121000；2.辽宁医学院附属第三医院 呼吸科，辽宁 锦州121000）

肺纤维化（pulmonary fibrosis，PF）是一种原因不明，发病率和死亡率日趋增加的炎性间质性肺部疾病。病理改变与疾病的严重程度相关，早期主要表现为弥漫性肺泡炎的炎症性改变，晚期则为成纤维细胞大量增殖、细胞外基质和胶原沉积增加、正常的肺组织被替代。其发病机制尚未完全明确，预后不良，临床治疗效果欠佳。

去整合素金属蛋白酶17（disintegrin and metalloproteinase 17，ADAM17）属于ADAMs家族成员之一，具有水解蛋白、使生物活性因子释放的作用[1]，从而活化多种跨膜生长因子、细胞因子和受体[2-4]，参与黏附、迁移和信号传递等多种细胞过程[5]。有研究发现，在人类肾脏细胞ADAM17通过促进TGF-α活化而发挥致纤维化的作用[5]。本文观察了ADAM17在肺纤维化组织中ADAM17基因的表达，以及细胞外间质Ⅲ型胶原蛋白、整合素6蛋白的表达，评价ADAM17在肺间质纤维化疾病中的作用及分析可能的机制。

1 材料和方法

1.1 患者与肺组织

患者来自辽宁医学院附属第三医院呼吸内、外科，病例收集时间为2008年4月-2011年4月。肺结节病16例，男8例，女8例，年龄33～54岁，均经临床特征、影像学、病理学活检确诊及证实，符合肺结节病诊断标准[5]；肺结核患者16例，男8例，女8例，年龄36～50岁，经内科胸腔镜获得病变组织，经病理证实为肺结核。非小细胞肺癌10例，男5例，女5例，年龄40～70岁；志愿者8名，男4例，女4例，年龄35～52岁。作为正常对照，来源于胸外科手术切除肺部良性肿瘤周边的正常肺组织，对照组患者均无吸烟史，胸片证实未见异常。以上均获得辽宁医学院医学伦理委员会的批准。

1.2 方法

1.2.1 Realtime RT-PCR 首先进行cDNA第一链合成，从-80℃冰箱中取出RNA，在室温下解冻，然后在0.2ml PCR管中配制反应溶液：总RNA 3μg，Oligo-dT（1μg/μl）0.5μl，dNTP mix（10 mM）1μl，ddH2O（DEPC）7.5μl，将反应管置于PCR仪中，65℃预变性5min。变性反应结束后在PCR管中配制cDNA第一链合成反应体系：5×first-strand bμffer 4.0μl，0.1MDTT 2.0μl，RNA inhibitor1.0μl，Superscript II（200U/μl）1.0μl，将PCR管子置于PCR仪中进行反应，42℃保温50min后，70℃变性15min。SYBR Green RT-PCR，反应体系：2×SYBR Green PCR buffer 12.5μl，ROX 0.5μl，primer（5 pmol）1μl，Template+ddH2O 11μl。50℃孵育2min，然后95℃，2min；接着进行40个循环，94℃，30 s；62℃，30 s。

引物：ADAM17上游引物：5'-AGTCTGCCTGGC TCATCTTT-3'，下游：5'-TACATAATACCCGGGTCAC ACTC-3'；GAPDH上游引物：5'-TGACTTCAACAGC GACACCCA-3'，下游引物：5'-CACCCTGTTGCTGTA GCCAAA-3'。

1.2.2 W estern blot 将处理后的肺组织细胞用PBS洗2次，加入变性细胞裂解液并收集，煮沸5min，12 000 g离心15min，取上清液，-20℃保存备用。BCA蛋白定量试剂盒测蛋白浓度，取20μg蛋白，进行SDS-PAGE，电压120 V，电泳时间2 h；然后将蛋白印迹到硝酸纤维素膜上，于含5%脱脂奶粉的封闭液中室温封闭2 h。一抗（1∶1 000）4℃过夜，二抗（1∶2 000）室温孵育1 h，ECL发光试剂对硝酸纤维素膜进行显色反应，X胶片曝光，拍照。凝胶成像系统在白光下对X光胶片扫描后，进行吸光度分析，以肌动蛋白作为内参，以与肌动蛋白的比值表示各组蛋白表达水平。

1.3 统计学处理

实验数据采用SPSS 18.0软件进行统计学分析，所有数据均以均值±标准差（±s）表示，以P<0.05为差异有统计学意义。

2 结果

2.1 去整合素金属蛋白酶17基因在肺间质纤维化组织中表达

ADAM17mRNA在肺结节病组、肺结核组、非小细胞肺癌中的表达水平均明显高于正常对照组（P<0.05）；在肺结节病组与肺结核组的表达水平比较差异无统计学意义（P>0.05）。肺癌组ADAM17 mRNA表达高于肺结节病组和肺结核组，差异有统计学意义（P<0.05）。见图1。

2.2 Ⅲ型胶原蛋白、整合素6蛋白在肺间质纤维化组织中表达

Ⅲ型胶原蛋白、整合素6蛋白在肺结节病组、肺结核组、非小细胞肺癌中的表达水平均明显高于正常对照组（P<0.05）；在肺结节病组与肺结核组的表达水平比较差异无统计学意义（P>0.05）。肺癌组Ⅲ型胶原蛋白、整合素6蛋白表达高于肺结节病组和肺结核组，差异有统计学意义（P<0.05）。

图1 去整合素金属蛋白酶17 mRNA在肺间质纤维化组织表达Real-time PCR结果

图2 Ⅲ型胶原蛋白、整合素6蛋白在肺间质纤维化组织表达Western blot结果

3 讨论

ADAM17参与多种炎症和增生性疾病，其病理生理作用与肾纤维化、多囊肾和其他慢性肾脏疾病有关[6]。ADAM17与TGF-α 共同存在于肾纤维化中，MELENHORST等[5]研究发现，在人类肾脏细胞ADAM17通过促进TGF-α 成熟而发挥致纤维化的作用。

在多种呼吸系统疾病包括COPD的气道重塑中，基质金属蛋白酶（MMPs）和金属蛋白酶解离素（ADAMs）发挥着重要的作用[6]。吸烟已被证实减低金属蛋白酶（TIMPs）内生组织抑制剂的表达，激活ADAM17。目前的研究发现，ADAM17在肿瘤细胞表面被激活和呈高表达状态[7]。在非小细胞肺癌中，通过ADAM17激活Notch 1导致EGFR表达增加[8]。可见，ADAM17与纤维化之间存在相关性。

本文以临床肺间质纤维化疾病（肺结节病、肺结核和非小细胞肺癌）组织作为研究对象，检测了ADAM17mRNA及细胞外基质蛋白Ⅲ型胶原蛋白、整合素6蛋白表达情况，结果肺间质纤维化疾病组织与正常肺组织对比，ADAM17及细胞外基质蛋白均表达加强，差异有统计学意义；尤其以肺癌组织表达最高，与正常对照组相比差异有统计学意义（P<0.01），与肺结节病及肺结核组对照亦有统计学意义。分析ADAM17可能是导致肺纤维化的因素之一，机制如下：①ADAM17功能多样，具有水解蛋白、使生物活性因子释放的功能，可能导致组织增生、纤维化。研究表明：至少有74种不同的膜蛋白的修饰活化过程受ADAM17的调控[10]。而对于系统的TGF-α、HB-EGF、AR的活化则是必需的[11]；这些蛋白通过特异的信号传导途径，最终可能导致细胞的异常增殖，致纤维化；②ADAM17可能使细胞与细胞之间、细胞与细胞外基质之间的作用减弱，破坏细胞与细胞基质之间的平衡，最终形成肉芽肿，并为细胞外基质沉积、肺纤维化的发生提供可能。本文得到的结果，细胞外基质蛋白表达增加即为纤维化机制之一；③在非小细胞肺癌中，ADAM17可激活Notch 1，导致一个EGFR表达增加的正反馈，从而使组织过度增殖，引起纤维化。

总之，肺纤维化疾病的组织ADAM17表达增高，伴随细胞外基质Ⅲ型胶原蛋白、整合素6蛋白表达同步增加，其作用机制可能是ADAM17打破了细胞与细胞外基质的表达平衡，导致基质蛋白沉积。确切的机制有待进一步研究。

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