当归补血颗粒早期干预结缔组织生长因子防治高血压肾损害及肾血管病变*

王琳娜 郭存霞 陈小永 杨华山

高血压肾损害是原发性高血压引起的良性小动脉性肾硬化和恶性小动脉性肾硬化及其伴有相应临床表现的疾病。高血压肾损害主要表现为血管的损害和肾间质纤维化。结缔组织生长因子（Connective Tissue Growth Factor，CTGF）是转化生长因子β1（Transform Growth Factorβ，TGF-β1）下游的重要致纤维化因子之一，早期干预CTGF表达，能阻止纤维化进程[1-2]。那么当归补血颗粒（Danggui Buxue granules，DG）早期干预对高血压肾损害的血管病变有无治疗作用，早期用药是否与CTGF表达相关，本研究将对此进行探讨。

1 资料与方法

1.1 一般资料 36只成年雄性自发性高血压大鼠（Spontaneously Hypertensive Rats，SHR）及10只同源雄性（Wistar-Kyoto，WKY）大鼠购于北京维通利华实验动物技术有限公司。大鼠试喂养1周，根据用药时间分早期组和晚期组，早期组选用8周龄SHR大鼠，晚期组选用12周龄SHR大鼠，并设置同龄WKY组大鼠为正常对照。早期组包括当归补血颗粒治疗组（DG组，10只）和生理盐水对照组（NS组，8只）和同龄WKY大鼠（5只）；晚期组包括当归补血颗粒治疗组（DG组，10只）和生理盐水对照组（NS组，8只）和同龄WKY大鼠（5只）。早期DG组6 g/（kg·d）灌胃，直至28周龄；晚期组以同样DG灌胃，直至28周龄；NS组以等量生理盐水灌胃，WKY大鼠不做任何处理。各组大鼠血压采用无创性尾套式大鼠血压计监测，每周1次，在大鼠清醒状态下测定尾动脉收缩压，每鼠测量3次，取均值，每周测血压两次。测血压前大鼠经37 ℃预热15 min。

1.2 主要材料 当归补血颗粒购自河南省中医院配方颗粒药房，选用黄芪30 g，当归6 g；尿β2微球蛋白按照放射免疫试剂盒由中国原子能科学研究所生产；总RNA提取试剂盒（RNeasyMini Kit试剂盒）购自美国Qiangen公司，逆转录试剂盒购自美国Promega公司，real-time PCR试剂盒（q-PCR Mixture）购自日本TaKaRa公司，荧光探针实时定量PCR仪（ABI 7900HT）购自美国Applied Biosystems公司，real-time PCR所用引物由上海生物工程有限公司合成，羊抗CTGF多克隆抗体购自美国Abcam公司，鼠抗β-actin单克隆抗体购自美国Sigma公司，二抗均购自美国Sigma公司，增强化学发光（ECL）显色液购自美国Pierce公司。

1.3 观察指标及检测方法

1.3.1 生物化学指标检测 各组大鼠在28周龄时处死，处死前1 d，代谢笼收集24 h尿液，-20 ℃保存。处死时经心脏取血2 mL，冰上静置10 min，加入抗凝管，3000 r/min离心5 min，取上清液。尿素氮和肌酐由HI-TACHI7150A自动生物化学分析仪检测，尿β2微球蛋白按照放射免疫试剂盒说明书进行检测。

1.3.2 组织病理学染色

1.3.2.1 肾脏组织HE染色 肾组织以4%多聚甲醛固定，常规包埋、切片，做HE染色观察肾组织病理变化，每张标本低倍镜下单盲依序观察左上、右上、左下、右下、中间5个肾小管间质视野，依据肾小管上皮细胞空泡变性、肾小管扩张、肾小管萎缩、红细胞管型、蛋白管型、间质水肿、间质纤维化、间质炎性细胞浸润等8项指标来观察肾间质病理改变并进行肾小管间质损伤指数评分[3]。

1.3.2.2 血管病变检测及评分 肾脏组织HE染色，规定皮质区的动脉横切面>5个，于光镜下对不同的管径动脉实际横断面总数进行计数。如果动脉管径在30~100 μm，其中膜肌层未低于2层，则该动脉属于小动脉；如果动脉管径<30 μm，同时平滑肌的细胞超过一层，则该动脉属于微动脉。借由计算机辅助病理分析系统、显微镜的目镜测微尺，对动脉内膜厚度、肾内的小动脉外径、微动脉的外径、动脉中膜的厚度、小动脉的内径以及微动脉的内径等进行准确测量。

参照Katafuchi等[4]的方法，肾间质小血管病变按光镜下的形态学特点分为4型：（1）透明变性（Hyalinosis，HL）型：动脉内膜透明样变或玻璃样物质沉积，可见弹力层分层，血管壁无坏死、无炎细胞浸润，无血管内膜增厚；（2）动脉硬化（Arteriosclerosis，AS）型：动脉血管内膜增厚、管腔不同程度狭窄及弹力层分层，管壁无坏死，可伴有动脉壁透明变性；（3）炎细胞浸润（Celluar infil-tration， CI）型：血管壁炎细胞浸润，可伴有管壁增厚、透明样变，无管壁坏死、内膜增厚；（4）纤维素变性坏死（Fibroid necrosis，FN）型：血管壁以纤维素样变性和/或坏死为主要表现，可伴有管腔狭窄。

动脉壁增厚的定义为：横断面肾内动脉内径<1/2外径。

肾动脉病变的半定量分级标准：0：无损害；1：<25%；2：25%~50%；3：≥50%。

1.3.3 Real-time PCR检测大鼠肾组织CTGF表达

1.3.3.1 组织总RNA的提取 按照用RNeasy Mini Kit试剂盒提取组织总RNA，抽提的总RNA用紫外分光光度计测OD值，比值在1.9~2.0，取3 μL RNA用1%琼脂糖凝胶电泳，可见5、18、28 s 3条清晰的RNA带，提示RNA无污染和降解。

1.3.3.2 cDNA的合成 按照用逆转录试剂盒合成cDNA，再以此cDNA为模板进行real-time PCR反应操作。Real-time PCR的引物序列如下：β-actin上游5'-GGCCAACCGTGAAAAGATGA-3'，下游5'-GACCAGAGGCATACAGGGACAA-3'；CTGF 上 游 5'-CCTGTGAAGCTGACCTAGAGGAAA-3'，下游5'-ACAGAACTTAGCCCGGTAGGTCTT-3'。

1.3.3.3 Real-time PCR检测 在ABI 7900型荧光定量PCR仪上进行扩增，96孔板加样，设计复孔和标准曲线，用Se-quence Detection System软件分析各检测样本的Ct值（达到一定荧光阈值的循环数），计算2-△△Ct评价TGF-β及CTGF在肾组织中的表达水平。

1.3.4 Western Blot检测肾组织CTGF蛋白表达

1.3.4.1 肾皮质总蛋白质的提取 取组织块100 mg加入组织总蛋白提取液1 mL匀浆，冰上裂解30 min，4 ℃以12 000 r/min离心15 min，取上清，按Bio-rad蛋白定量试剂盒方法进行蛋白定量，取80 μL上清加5×变性缓冲液20 μL混匀，100 ℃下变性10 min。

1.3.4.2 免疫印迹检测 灌制10%的分离胶和4%的堆积胶，取总蛋白100 μg行上样电泳，电泳结束后260 mA电转印90 min至PVDF膜。封闭液（5%牛奶）摇床上封闭2 h，加入羊抗CTGF多克隆抗体（1∶200），4 ℃摇床过夜。洗膜后再加相应的二抗，室温孵育1 h，加ECL液后显影、定影，以β-actin为内参照。将胶片扫描后，采用Quantity One软件分析各条带灰度值，将各目的条带灰度值除以同一标本内参照β-actin条带灰度值得到一比值，将该比值除以同一胶片上假手术组的比值作为该目的蛋白表达量的半定量结果。

1.4 统计学处理 采用SPSS 17.0软件进行分析，计量资料采用（±s）表示，组间比较采用单因素方差分析，以P<0.05为差异有统计学意义。

2 结果

2.1 各组大鼠血压、血肌酐、尿素氮和尿β2微球蛋白（β2MG）水平比较 SHR血压较WKY大鼠明显升高，差异有统计学意义（P<0.05）。经治疗后，DG组大鼠血压较NS组差异无统计学意义（P>0.05），说明DG无降压作用。早期组治疗后，DG组血肌酐、尿素氮和尿β2MG水平均较NS明显降低，差异有统计学意义（P<0.05）。晚期组治疗后，DG尿β2MG与NS比较，差异有统计学意义（P<0.05）；DG组血肌酐、尿素氮与NS比较，有下降趋势但差异无统计学意义（P>0.05），见表 1。

表1 各组大鼠治疗前后各项指标的比较（x-±s）

2.2 肾间质纤维化和血管病变评分 SHR肾间质损害及血管病变较WKY大鼠明显增加，差异有统计学意义（P<0.05）；经治疗后，DG组大鼠肾间质损害及血管病变均较NS组明显降低，差异有统计学意义（P<0.05）；早期组经DG治疗后，间质纤维化和血管病变程度均较生理盐水对照组明显好转，差异有统计学意义（P<0.01），治疗效果优于晚期组，各组比较见表2。

2.3 各组大鼠治疗前后肾组织CTGF mRNA和蛋白表达 SHR肾组织CTGF mRNA和蛋白表达均较WKY大鼠明显增加，差异有统计学意义（P<0.05）；晚期组经治疗后，DG组大鼠肾间质损害及血管病变均较NS组明显降低，差异有统计学意义（P<0.05）；早期组经DG治疗后，间质纤维化和血管病变程度均较NS组明显好转，差异有统计学意义（P<0.01），治疗效果优于晚期组，见表2、图1。

表2 各组大鼠治疗前后肾间质纤维化和血管病变评分比较（x-±s） 分

表3 各组大鼠治疗前后CTGF mRNA和蛋白表达情况比较（x-±s）

图1 各组大鼠治疗前后肾组织CTGF mRNA和蛋白表达注：1：WKY大鼠；2：早期DG组；3：早期NS组；4：晚期DG粒组；5：晚期NS组

3 讨论

高血压肾损害主要表现为血管的损害和间质纤维化，血管损害典型病理表现为肾小动脉的肌内膜肥厚和/或细小动脉的玻璃样变。高血压造成的压力改变，引起肌型小动脉内膜胶原纤维及弹力纤维增生，内弹力膜分裂，中膜平滑肌细胞增生肥大，同时伴纤维组织增生，造成血管壁增厚，管腔狭窄。高血压造成的细动脉反复痉挛，内皮细胞受损，内皮间隙扩大，血浆蛋白渗入内皮下间隙；同时内皮细胞及中膜平滑肌细胞分泌细胞外基质增多、平滑肌凋亡，最终管壁被上述物质替代，发生细小动脉玻璃样变，进而导致肾小球及肾小管的缺血性改变，后期表现为肾小球废弃性或固化性硬化，以及肾小管萎缩及间质纤维化。

CTGF是TGF-β1促纤维化作用的重要下游介质，在人体心、脑、肺、肝、肾、肌肉、胎盘、结缔组织中均有表达，可抑制细胞外基质（Extracellular Matrix，ECM）降解，促进ECM生成、沉积，并可通过促进细胞有丝分裂、增殖来诱导、刺激成纤维细胞活化、增殖[5-7]。CTGF在许多疾病的致纤维化作用中介导了TGF-β1的许多功能。但是TGF-β1的生物学作用广泛，阻断TGF-β1可能会影响重要功能而产生不良反应，而对下游的因子，如CTGF阻断和干预，则更具特异性。

当归补血汤是一首来自金元时代李东垣《内外伤辩惑论》的经典益气补血方剂，由黄芪和当归两味药以5：1比分组成。该方在配伍时重用黄芪大补脾肾之气，以资气血生化之源，配以当归苷辛而温，养血和营，黄芪为君，当归为臣，目前临床上多使用当归补血颗粒。黄芪甲苷是黄芪的主要成分之一，是评价黄芪药材质量的优劣标准，有抑制肾间质纤维化的作用[8]；阿魏酸为非胍类内皮素受体拮抗剂，是当归的主要有效成份之一，为其活血成分的主要物质基础，阿魏酸具有抗血小板聚集、抗炎、抗氧化、抗纤维化的作用。

黄芪当归配伍有明确的科学依据。黄芪甲苷难溶于水，生物利用度差，而阿魏酸能明显促进黄芪甲肝在大鼠十二指肠的吸收作用[9]。芪归配比5：1组阿魏酸析出比例最高，大鼠免疫功能及抗炎能力改善影响最大[10-12]。

SHR的血压升高是由多基因遗传决定的，与人类高血压病十分类似，SHR出生后血压随鼠龄不断升高，3~4个月时为高血压确立期，6个月时血压升到最高水平，幼年SHR交感活性增高，随血压升高进一步出现心、脑、肾等并发症。本研究选用8周为SHR大鼠早期干预点，这时SHR血压已开始升高但尚未出现明显并发症；选用12周为晚期干预点，这时SHR血压已经出现明显升高，各种并发症开始出现。

本研究发现，当归补血颗粒早期干预能明显降低SHR血肌酐和尿素氮水平、减少尿β2MG水平，改善高血压肾间质纤维化程度和肾血管病变程度，当归补血颗粒的这一作用与降低肾组织CTGF mRNA和蛋白表达相关，早期用药效果优于晚期；当归补血颗粒对大鼠血压无影响，说明当归补血颗粒治疗作用与血流动力学无关。当归补血颗粒能通过早期干预CTGF表达缓解高血压肾损害肾血管病变和间质纤维化水平。本研究为当归补血颗粒在高血压肾损害早期治疗方面的临床应用提供了试验参考。

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