血必净注射液对系统性红斑狼疮小鼠脾脏T淋巴细胞的免疫调节作用

王彦博 赵艳琴 丁砚兰 王 强

(1. 解放军总医院第一附属医院全军创伤修复与组织再生重点实验室暨皮肤损伤修复与组织再生北京市重点实验室，北京 100048; 2.武警北京总队医院， 北京 100027； 3.中国疾病预防控制中心， 北京 102206)

Key words Systemic lupus erythematosus Xuebijing injection T lymphocyte Cytokine

·论 著·

血必净注射液对系统性红斑狼疮小鼠脾脏T淋巴细胞的免疫调节作用

王彦博1赵艳琴2丁砚兰2王 强3

(1. 解放军总医院第一附属医院全军创伤修复与组织再生重点实验室暨皮肤损伤修复与组织再生北京市重点实验室，北京 100048; 2.武警北京总队医院， 北京 100027； 3.中国疾病预防控制中心， 北京 102206)

目的：探讨血必净注射液对系统性红斑狼疮(SLE)小鼠T淋巴细胞的免疫调节作用。方法：以清洁级EB病毒膜抗原BLLF1基因转基因小鼠30只为SLE模型小鼠，随机分为模型组(8周龄和10周龄各5只)、8周龄治疗组(10只)和10周龄治疗组(10只)。两治疗组给予血必净注射液6.4 ml/kg腹腔内注射，每日1次，连续14 d。治疗14 d后处死，分离脾脏，提取DC和T淋巴细胞，荧光定量PCR和酶联免疫吸附试验检测T细胞孵育上清和脾组织匀浆液IL-2和TNF-α基因及细胞因子表达水平。结果：与正常对照组比较，SLE小鼠IL-4、TNF-α含量显著升高，而IL-2、 IFN-γ水平明显降低，脾脏组织及T淋巴细胞IL-2的基因表达显著下降，而TNF-α基因表达则明显升高(P<0.05或P<0.01)。给予血必净注射液治疗后，与模型组比较，狼疮鼠IL-4、TNF-α含量显著降低，而IL-2、IFN-γ水平明显升高，IL-2基因表达显著升高，TNF-α基因表达明显降低，差异具有统计学意义(P<0.05或P<0.01)。两个治疗组之间比较差异无统计学意义(P>0.05)。结论：血必净治疗能够将脾脏的Th2细胞转化为Th1细胞，改变Th1 /Th2的比例和机体的免疫应答类型，对系统性红斑狼疮的免疫功能产生影响。

系统性红斑狼疮 血必净注射液 T淋巴细胞 细胞因子

Key words Systemic lupus erythematosus Xuebijing injection T lymphocyte Cytokine

系统性红斑狼疮(systemic lupus erythematosus，SLE)是一种免疫复合物在各种组织中沉积伴有炎症性坏死现象的自身免疫性疾病。异常的T淋巴细胞过多地产生对B淋巴细胞刺激性的细胞因子，致B淋巴细胞高度活化，产生大量自身抗体,是SLE的免疫学特征。研究表明，细胞因子网络失衡是SLE发病机制中的重要组成部分，T辅助细胞(Th)是细胞因子的重要来源，Thl/Th2平衡在SLE免疫调控中发挥重要作用[1]。血必净注射液以古方血府逐瘀汤为基础研制而成，主要成分包括赤芍、川芎、丹参、红花、当归等5味中药[2]，临床上主要用于治疗脓毒症。血必净注射液对脓毒症具有免疫调节作用，并能维护机体的脏器功能。SLE作为一种典型的自身免疫性疾病，T淋巴细胞和细胞因子的紊乱贯穿整个发病过程。本研究拟以此为研究切入点，观察并探讨血必净注射液对SLE模型动物T淋巴细胞免疫功能的影响及其调节机制。

1 材料和方法

1.1 实验分组 远交系昆明种雌性小鼠10只，体质量30～40 g，由中国医学科学院实验动物中心提供。雌性SLE模型鼠30只，体质量30～40 g，EB病毒膜抗原BLLF1基因转基因小鼠，购自北京大学医学部实验动物研究中心。小鼠在室温20～25 ℃、相对湿度40%～70%、昼夜明暗交替(12 h明/12 h暗)的条件下饲养5 d，随机将小鼠平均分为3组(n=10)：模型组(8周龄和10周龄各5只)、8周龄给药组、10周龄给药组。两个给药组均每日1次腹腔内注射血必净注射液(天津红日药业股份有限公司产品)6.4 ml/kg，连续14 d。

1.2 小鼠脾脏树突状细胞(DC)的分离与鉴定 于给药14 d后处死小鼠，无菌操作，取小鼠脾脏组织，按照文献[3-4]的实验方法制备单个核细胞悬液，将单个核细胞悬液与抗小鼠DC的CD11c+免疫磁珠(德国Mihenyi Biotec公司)共孵育，用MiniMACS磁化细胞分选仪(德国Mihenyi Biotec公司)分离收集DC并进行细胞活性和纯度鉴定。

1.3 小鼠脾脏T淋巴细胞的分离与鉴定 将上述方法获取的单个核细胞悬液于细胞培养瓶中培养 2 h，利用单个核细胞中除T细胞外其他细胞大多贴壁生长的特性，收集未贴壁细胞，离心后获得T细胞，台盼蓝检测分离细胞的活性大于97%。10%FCS-RPMI 1640完全培养基重悬脾T淋巴细胞，调整细胞密度为5×106/ml。

1.4 RT-PCR试验 将预先获得的小鼠脾脏组织和T淋巴细胞放置在冰浴盒中，整个操作过程在冰浴中进行，采用RT-PCR试剂盒(美国Promega公司和北京赛百盛生物工程技术公司)。小鼠TNF-α：扩增片段123 bp，正义链5’- TCTCGAACCCCGAGTGACAA-3’，反义链5’-ACCGCACCTCGACTCTC TAT-3’；小鼠IL-2： 扩增片段256 bp，正义链5’-ACTCACCAGGATGCTCACAT-3’，反义链5’-AGACTTGTCTACCTAATGGA-3’。

1.4.1 RNA提取及cDNA合成 所用实验样品均采用异硫氰酸胍一步提取法，预先进行去RNAase处理。按照说明书从脾脏组织和T淋巴细胞中提取RNA，用紫外分光光度仪测定RNA浓度及纯度，然后采用逆转录酶和随机引物进行逆转录。

1.4.2 荧光定量PCR 在PCR产物与上样缓冲液的混合液中，加入琼脂糖凝胶，放置于电泳槽中，进行60 min电泳。紫外灯观察确定扩增片段无差错和杂带后进行PCR循环。所用物品均经高压灭菌、去RNA酶处理，采用高温启动法进行实时荧光定量PCR循环。PCR体系的组成：SYBR Green PCR Master MIX 12.0l，3’ 引物 (5mol/L) 1.0l，5’ 引物 (5mol/L) 1.0l以及逆转录产物 (cDNA) 1.0l。加无菌去离子水将混合液补至20l，混匀并封膜。在7500荧光定量PCR仪(美国Applied Biosystems公司产品)上进行循环检测后，取相对定量(RQ)值进行结果统计。

1.5 ELISA法检测细胞因子 根据既往的实验结果[5]，在各组小鼠的DC与T淋巴细胞以1:100的比例相互作用3 d及5 d时，T淋巴细胞增殖活性升高幅度尤为明显。因此选取DC与T淋巴细胞以 1:100 的比例作用3 d及5 d时的共培养上清液，应用ELISA试剂盒(上海医科赛生物制品有限公司)分别检测上清液中IL-2、IL-4、IFN-γ和TNF-α水平，所有步骤严格按照说明书操作步骤进行。

2 结 果

2.1 各组小鼠DC对T淋巴细胞功能性极化(Th1/Th2漂移)的影响 小鼠DC与T淋巴细胞以1:100的比例相互作用3 d及5 d时，与正常对照组比较，SLE模型小鼠的IL-2、IFN-γ含量明显降低，而IL-4、TNF-α的含量则显著升高(除共培养5 d时IL-2和TNF-α两组间差异无显著性外，P<0.05或P<0.01)；并且共培养的时间长短对细胞因子生成也有明显影响，IL-2、IFN-γ含量降低和IL-4、TNF-α水平升高均以第3天最为显著(P<0.01)。与模型组比较，经血必净注射液治疗的8周龄和10周龄给药组小鼠IL-4、TNF-α含量显著降低(P<0.05或P<0.01)，而IL-2、IFN-γ的水平明显升高(P<0.05或P<0.01)，与正常对照比较差异无统计学意义(P>0.05)。两治疗组间比较差异均无统计学意义(P>0.05)。见表1和表2。

组别共培养第3天共培养第5天IL-2IFN-γIL-2IFN-γ正常对照组1898.735±110.657695.843±27.0181369.948±209.440203.452±24.442模型组001077.502±142.801**00499.596±16.463**1052.246±234.3410096.877±28.771*8周龄给药组01907.556±97.751##0426.137±42.964#1387.968±189.686125.795±45.91910周龄给药组01914.362±137.616#000480.929±10.242##1370.768±138.109177.691±52.398

注：与正常对照组比较：*P<0.05,**P<0.01；与模型组比较：#P<0.05，##P<0.01

组别共培养第3天共培养第5天IL-4 TNF-α IL-4 TNF-α 正常对照组024.754±4.9190117.703±6.676075.101±4.646120.960±12.307模型组175.315±9.776**175.011±7.004**148.715±19.219*155.724±25.5238周龄给药组054.538±9.542##116.791±4.578##115.091±25.079107.676±24.16610周龄给药组032.099±5.034##108.327±10.269#085.685±15.769132.809±17.724

注：与正常对照组比较：*P<0.05，**P<0.01；与模型组比较：#P<0.05，##P<0.01

2.2 各组小鼠脾组织及T淋巴细胞IL-2、TNF-α基因表达的变化 与正常对照组比较，模型组小鼠脾组织及T淋巴细胞IL-2 mRNA的表达显著降低(P<0.05或P<0.01)，TNF-α mRNA的表达则显著升高(P<0.05或P<0.01)。与模型组比较，两给药组IL-2 mRNA的表达明显升高，TNF-α mRNA的表达则明显降低(P<0.05或P<0.01)，两给药组间比较差异无统计学意义(P>0.05)。说明血必净注射液治疗能影响IL-2和TNF-α的基因表达水平。见表3。

组别脾组织T淋巴细胞IL-2mRNA TNF-αmRNA IL-2mRNA TNF-αmRNA 正常对照组模型组8周龄给药组10周龄给药组24.28±1.8413.07±1.32**31.62±3.91*##35.10±2.57*##24.28±1.8449.01±2.66**33.95±2.82#30.12±3.13#1.30±0.090.32±0.12*1.73±0.23#*2.10±0.23##*1.30±0.093.37±0.34*2.30±0.16#1.77±0.32#

注：与正常对照组比较：*P<0.05，**P<0.01；与模型组比较：#P<0.05，##P<0.01

3 讨 论

SLE发病机制尚不明确。研究表明SLE患者Thl/Th2失调并有向Th2漂移的现象。在淋巴细胞功能异常引起的免疫抑制中，作为免疫系统重要的调节细胞，T淋巴细胞可能发挥着重要的作用[6]。

效应性T细胞的分化方向，是由DC与T淋巴细胞相互作用的过程中释放的细胞因子决定的。分化成Th1细胞后，主要诱导Ⅰ型应答反应，释放干扰素(IFN)-γ、IL-12和TNF-β，介导细胞免疫。分化成Th2细胞后，主要诱导Ⅱ型应答反应，释放IL-4和IL-10等细胞因子，介导体液免疫。

IL-2是一种具有多种生物活性的细胞因子，是由辅助性T淋巴细胞分泌的淋巴因子[7]，具有免疫增强作用，能够使细胞毒性T淋巴细胞、NK细胞的能力增强[8]，是在机体免疫调节中能够参与细胞免疫的一个非常关键的细胞因子。它能促使T细胞活化增殖，使其分化为效应T细胞，还可刺激TNF-α、IFN-γ等细胞因子的分泌。在T细胞的活化增殖以及转化的过程中，IL-2均具有重要的作用。

IFN-γ是细胞介导的免疫应答中的关键成分，其主要活性就是参与免疫调节，在体内起到双向调节作用。一方面，IFN-γ可激活NK等细胞，增强抗病毒、抗肿瘤的功能；另一方面，IFN-γ能抑制B细胞分泌IgE，还能恢复抑制性T细胞的功能，减少免疫复合物的局部沉积。

IL-4主要由活化Th2亚群产生，对于B细胞、T细胞、肥大细胞、单核细胞和造血细胞都有免疫调节作用，在Th1和Th2应答类型的调控中可能还具有重要意义，IL-4不仅能促进Th细胞向Th2细胞分化，而且还具有促进Th细胞向Th1细胞分化的潜能，

TNF-α主要由受刺激的单核细胞、T细胞和细胞分裂素激活的B细胞分泌，是一种具有多重局部和系统生物活性的细胞因子[9]，具有免疫调节活性、抗肿瘤活性，并参与介导炎症反应的许多病理生理过程[10]。

各亚群的Th细胞因子诱导Th0向各自细胞亚群分化，同时还促进各自Th细胞亚群活化，这是Thl/Th2细胞效应的自身促进作用。IL-2诱导Th0细胞向Thl细胞亚群分化，TNF-α诱导Th0细胞向Th2细胞亚群分化。IL-4能抑制Th0 向Th1 分化，促进Th0 分化为Th2，与IFN-γ相互作用，改变Th1 /Th2的比例和机体的免疫应答类型。IFN-γ能促进巨噬细胞分泌IL-12，IL-12又能促进T 细胞、NK 细胞产生大量的TNF-α、IL-2、IL-6等细胞因子，二者形成正反馈，强烈诱导Th0 分化为Th1，调节着免疫应答的强弱和类型,在机体细胞免疫中发挥作用。Thl/Th2细胞效应在生理情况下保持着相对的平衡，两型免疫应答之间存在着交互负反馈的调节作用，保持正常的稳定关系。

血必净注射液是在“菌、毒、炎并治”的理论指导下研制而成，主要成分包括赤芍、川芎、丹参、红花、当归等5味中药。Wu等[11]发现川芎嗪可明显改善大鼠的有效循环状况，抑制诱导性一氧化氮合酶(iNOS)表达，降低TNF-α水平。Genfa等[12]从42味中草药中筛选出能对抗内毒素的8种中药单剂，发现赤芍与脂质A的亲和力最强，具有明显降低血浆TNF-α水平、治疗脓毒症的作用。

本研究通过SLE小鼠模型观察了DC对脾脏T淋巴细胞免疫功能的影响，以T淋巴细胞分泌的细胞因子IL-4、IL-2和IFN-γ、TNF-α为标志，定量观察血必净治疗后T淋巴细胞分泌细胞因子的蛋白表达水平。实验结果显示，与正常对照组比较，模型组动物脾脏T淋巴细胞与DC细胞共培养后IL-4和TNF-α的水平均明显升高，而IL-2和IFN-γ则明显降低(P<0.05或P<0.01)，说明在SLE中，T淋巴细胞向Th2功能群漂移。给予SLE小鼠血必净治疗后，与模型组比较，IL-4和TNF-α含量显著降低而IL-2和IFN-γ的水平明显升高(P<0.05或P<0.01)。同时，与正常对照组比较，模型组小鼠脾脏组织及T淋巴细胞IL-2 mRNA的表达显著降低，TNF-α mRNA的表达则显著升高(P<0.05或P<0.01)。血必净治疗后， IL-2 mRNA的表达明显升高而TNF-α mRNA的表达则明显降低(P<0.05或P<0.01)。

上述结果表明，血必净注射液治疗可抑制育龄早期(8周龄)和育龄晚期(10周龄)SLE小鼠脾T淋巴细胞向Th2漂移，促进T淋巴细胞向Th1漂移，改变Th1 /Th2的比例和机体的免疫应答类型，有效改善SLE时因Th1 /Th2的比例失衡导致的免疫紊乱，为血必净注射液治疗SLE提供了有力的免疫学证据。

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Effect of Xuebijing injection (血必净注射液) on immune function of T lymphocytes in systemic lupus erythematosus in mice

Wang Yanbo*, Zhao Yanqin, Ding Yanlan, Wang Qiang3.*

Key Research Laboratory of Tissue Repair and Regeneration of PLA, and Beijing Key Research Laboratory of Skin Injury, Repair and Regeneration, First Hospital Affiliated to the Chinese PLA General Hospital, Beijing 100048, China

Wang Qiang(E-mail:jason2019@sina.cn) Zhao Yanqin(E-mail:BJWLinda@sina.com.cn)

Objective:To observe the effect of Xuebijing injection (血必净注射液) on T lymphocyte and its potential mechanisms in systemic lupus erythematosus (SLE).Methods:A widely used mouse model, SLE-prone BLLF1 mice aged 8-10 weeks, was employed. Xuebijing injection in a dose of 6.4 ml/kg was given via the intraperitoneal administration in the Xuebijing treatment group. Spleen sample was divided as following: one part was used to procure DC with MACS microbeads and T cell by using column of nylon wool, and the other part was used to determine gene and protein expressions of various cytokines. Cells were cultured and the contents of cytokines released into supernatants were determined. The mRNA expression was measured by real-time quantitative PCR. All cytokines were determined in supernatant by ELISA kits for mice.Results:In the model control group, the levels of IL-4 and TNF-α were increased significantly, but the levels of IL-2 and IFN-γ were decreased markedly. The gene expressions of IL-2 were also decreased and TNF-α were increased. Xuebijing treatment could significantly down-regulate the release of IL-4, TNF-α and decrease in IL-2, IFN-γ. Conclusions: Treatment with Xuebijing injection might influence the polarization of T cells in animals with SLE and induced Th cells to drift to Th1 cells.

10.3969/j.issn.1672-8521.2015.01.008

国家自然科学基金资助项目(81071545, 81130035)；国家重点基础研究发展计划项目(2012CB518102)；创伤、烧伤与复合伤国家重点实验室开放课题(SKLKF200902, SKLKF201002)

王强， 副主任医师 (E-mail: jason2019@sina.cn) 赵艳琴，副主任护师(E-mail:BJWJLinda@sina.com.cn)

2015-03-01)