6种中药水溶性粗提物对鸡源耐药奇异变形杆菌的抑菌活性研究

6种中药水溶性粗提物对鸡源耐药奇异变形杆菌的抑菌活性研究

韩镌竹1，李欣南1，周铁2，宁宜宝3
（1.辽宁省兽药饲料畜产品质量安全检测中心，辽宁沈阳110016；2.铁岭市兽药饲料畜产品质量安全检测站，辽宁铁岭112099；3.中国兽医药品监察所，北京海淀100081）

对获得的91株鸡源奇异变形杆菌进行了11种抗生素敏感性测定，从中筛选出5株耐药性较高的耐药奇异变形杆菌。以奇异变形杆菌标准菌株为模型，进行了31种中药水溶性粗提物抑菌活性研究。以庆大霉素和青霉素为参照，采用管碟法对6种中药水溶性粗提物的抑菌活性进行效价估算。最终将6种中药水溶性粗提物作用于筛选出的耐药奇异变形杆菌，验证其抑菌活性。结果表明，31种中药中地榆、虎杖、大黄、黄芩、大青叶和绵马贯众对奇异变形杆菌标准菌株的抑菌效果最佳，对耐药奇异变形杆菌抑菌效果明显优于试验的11种抗生素。

耐药；奇异变形杆菌；中药；抑菌活性

奇异变形杆菌（Proteusmirabilis，PM）属于肠杆菌科变形杆菌属，革兰阴性菌，是人和动物的寄生菌和病原菌［1-2］。污染了奇异变形杆菌的肉类不论生熟常能引起人的食物中毒［3］，同时奇异变形杆菌又是一种尿路病原体［4-5］，引起的泌尿系统感染会使病情复杂化。而抗生素对产生了耐药性的奇异变形杆菌却是毫无办法［6-8］，只能任由其发展。中药药源广泛，毒副作用小，已在预防和治疗人畜疾病方面发挥了巨大的作用［9-11］。为获得临床治疗奇异变形杆菌相关疾病更有效的药物，本试验采用奇异变形杆菌标准菌株进行31种中药水溶性粗提物抑菌活性研究，对筛选出的具有抑菌活性的中药水溶性粗提物进行了当量效价测定，并以筛选出的表型耐药奇异变形杆菌进行活性验证。

1 材料与方法

1.1 菌株来源质控菌株有大肠埃希菌ATCC25922、奇异变形杆菌ATCC25933、短小芽孢杆菌CMCC（B）63202、藤黄微球菌CMCC（B）28001，均购自中国兽医药品监察所；试验菌株于某肉鸡养殖场分离获得。1.2仪器生物安全柜CLASSⅡ（美国NUAIRE公司）；全自动高压灭菌器（日本三洋电器集团）；N-EVAP112氮吹仪（美国ORGANOMATION公司）；钢管；玻璃平皿。

1.3 培养基与材料抗生素检定培养基Ⅱ号、抗生素检定培养基Ⅰ号、营养琼脂培养基等，均购自北京陆桥生物技术有限责任公司；APINaCl 0.85%培养基、ID32E鉴定条，均购自BIOMERIEUX公司；奇异变形杆菌药敏检测板，购自天津市金章科技发展有限公司；陈皮、苦参、柴胡、菟丝子、黄芪、香附、羌活、甘草、川芎、地榆、虎杖、肉苁蓉、四叶参、起阳石、丁香、当归、秦艽、柴柏、枳壳、白芍、白头翁、大黄、党参、板蓝根、锁阳、石见穿、绵马贯众、大青叶、白硇砂、栀子及黄芩31种中药饮片，购自药房；青霉素、庆大霉素，购自中国兽医药品监察所。

1.4 方法

1.4.1 微量稀释法药敏试验采用美国临床实验室标准化协会（Clinical and Laboratory Standards In⁃stitute，CLSI）规定的微量稀释法进行药物敏感性试验，具体过程参考文献［12-13］。

1.4.2 中药有效成分提取及药敏板制备取31种中药饮片各30 g于100 mL水中，超声60min，震荡过夜，沸水浴煮30 min，10 000 r/min离心30 min，取上清，氮吹浓缩至5 mL，制备成中药水溶性粗提物浓缩液。将该浓缩液稀释成1.0 g/mL后加入96孔板中，进行倍比稀释，使每一排的药物浓度为前排的1/2，终浓度为1/128 g/m L，风干备用。

1.4.3 中药水溶性粗提物当量效价测定用pH值7.0磷酸盐缓冲液分别洗下短小芽孢杆菌和藤黄微球菌斜面培养后的菌苔，配成终浓度分别为2.0×107CFU/m L和3.0×108CFU/m L的菌悬液。按照抗生素对应的效价计算后分别称取0.0070 g青霉素钠和0.0157 g庆大霉素标准品于100mL容量瓶中配成储备液。再用磷酸盐缓冲液将中药水溶性粗提物浓缩液和抗生素标准品储备液稀释到合适浓度，使抑菌圈直径大小在20 mm±2mm范围内。具体方法参见《中国兽药典》［14］。

1.4.4 中药水溶性粗提物抑菌活性验证以筛选出的表型耐药奇异变形杆菌为研究对象，采用微量稀释法和管碟法，对6种中药水溶性粗提物抑菌活性进行验证。管碟法和微量稀释法中奇异变形杆菌终浓度分别为5.0×106CFU/mL和1.0× 106CFU/mL，庆大霉素和青霉素的工作浓度分别为16μg/mL和64μg/mL。

2 结果与分析

2.1 表型耐药奇异变形杆菌筛选对分离鉴定得到的91株奇异变形杆菌，进行了氨苄西林、庆大霉素等11种抗菌药物敏感性测定。并进行了多重抗生素耐药性分析，从中筛选出5株耐药表型最强的菌株作为试验菌株进行中药抑菌活性筛选。5株表型耐药奇异变形杆菌对氨苄西林、庆大霉素、四环素、大观霉素、氟苯尼考、磺胺异恶唑、复方新诺明、多西环素和恩诺沙星9种抗生素的抑菌浓度分别为≥32μg/mL（R）、≥16μg/mL（R）、≥16μg/mL（R）、≥256μg/mL（R）、≥16μg/mL（R）、≥512μg/mL（R）、≥4/76μg/mL（R）、32μg/ mL（R）和≥2μg/mL（I）。对敏感的抗生素头孢噻呋和粘杆菌素的抑菌浓度为≥8μg/mL（S）和≥2 μg/mL（S）。

2.2 中药水溶性粗提物抑菌活性筛选选取31种中药对奇异变形杆菌标准菌株进行抑菌活性筛选，陈皮、羌活、地榆、虎杖、肉苁蓉、柴胡、大黄、黄芩、当归、枳壳、锁阳、绵马贯众、大青叶、白硇砂和栀子15种中药水溶性粗提物对奇异变形杆菌有不同程度的抑菌作用，其中地榆、虎杖、大黄、黄芩、大青叶和绵马贯众6种中药的抑菌作用最强，另外17种中药水溶性粗提物均无抑菌活性。

2.3 中药水溶性粗提物当量效价的测定以庆大霉素和青霉素为参照，对上述6种中药采用革兰阴性菌短小芽孢杆菌和革兰阳性菌藤黄微球菌分别进行活力测定。将中药水溶性粗提物与水密度进行质量比较换算后，得到表1所示的浓度范围，在革兰阴性菌和革兰阳性菌上中药水溶性粗提物的抑菌圈与标准品抑菌圈相当，均为20mm±2mm，此时中药水溶性粗提物的效价当量于抗生素效价。

2.4 中药水溶性粗提物抑菌活性验证使用微量稀释法和管碟法进行验证。当庆大霉素浓度为16μg/mL、青霉素浓度为64μg/mL，对选用的表型耐药奇异变形杆菌无抑菌活性。而6种中药水溶性粗提物在表1低浓度范围均具有良好的抑菌活性，结果见图1。说明在适当条件下，大黄、大青叶、地榆、虎杖、黄芩、绵马贯众能够替代抗生素进行革兰阳性菌和革兰阴性菌感染的治疗。

3 讨论

图1 6种中药水溶性粗提物对表型耐药奇异变形杆菌的抑菌效果比较

通过试验结果可以看出，对于已经产生耐药的细菌，抗生素单纯增加剂量不能达到抑菌作用，反而成为药物压力，促进耐药进一步发展。而中药与西药的作用机理不同，长期使用不易产生耐药性，且选择压力小，是兽医临床替代抗生素的良好选择。本试验测试了水煎中药的抑菌效果，但由于中药中有效成分复杂，单使用水煎法可能导致有效成分的流失，应考察多种提取方法及其提取物的抑菌活性，期待获得更有效的提取物。且对肉苁蓉等5种中药尚待进一步研究。

表1 大黄、大青叶、地榆、虎杖、黄芩和绵马贯众的当量效价

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S853.72

B

0529-6005（2015）12-0059-03

2014-08-05

国家十二五948计划兽药监管技术引进［2011-G14（4）］

韩镌竹（1985-），女，硕士，研究方向为动物源细菌耐药性研究，E-mail：261131312@qq.com

宁宜宝，E-mail：ningyibao@ivdc.gov.cn