鹅源鸭疫里默菌的分离鉴定与药敏试验

胡晓苗，戴 银，沈学怀，赵瑞宏，侯宏艳，潘孝成，周学利，张丹俊，朱传明

（安徽省农业科学院畜牧兽医研究所，安徽合肥230031）

鹅源鸭疫里默菌的分离鉴定与药敏试验

胡晓苗，戴 银，沈学怀，赵瑞宏，侯宏艳，潘孝成，周学利，张丹俊，朱传明

（安徽省农业科学院畜牧兽医研究所，安徽合肥230031）

鹅传染性浆膜炎是由鸭疫里默菌（Riemerella anatipestifer，RA）引起鹅的以纤维蛋白渗出并在脏器表面沉积，胸、腹腔大量积液为特征的一种接触传染性疾病，其特征是纤维素性心包炎、肝周炎、气囊炎、干酪型输卵管炎和脑膜炎。2～8周龄鹅多发，发病率90%，死亡率10%～40%，给养鹅业造成很大经济损失。国内有关鹅传染性浆膜炎研究比较少，胡清海［1］研究表明，2株鹅源RA分离株对雏鸭和雏鹅的致病性没鸭源分离株强，而且对雏鹅的致病性比雏鸭强。赵宝华［2］从扬州郊区发病鹅场分离到1株对鹅具有很强致病性的鹅源RA。吕敏娜［3］分离鉴定出1株血清1型的RA，序列分析显示，鹅源分离株与鸭源RA处于同一进化支上，与鸡源RA进化关系稍远，对鸭和鹅均有高致病性，自家疫苗能够较好地保护雏鹅。作者对来自安徽省两家疑似患有RA鹅群的病料，进行了细菌分离、生化试验和PCR方法鉴定，分离鉴定出2例鹅源RA，为该病的诊断和防治提供科学依据。

1 材料与方法

1.1 病料来源选择两家鹅场具有典型纤维素性心包炎、肝周炎、气囊炎、脑膜炎以及肠炎的病死鹅，无菌操作采集患病鹅的肝脏与脑组织。

1.2 细菌分离培养无菌环境下操作，取病死鹅的肝脏和脑接种在胰酶大豆琼脂培养基（TSA培养基）上，在37℃二氧化碳恒温箱中培养36 h。若未培养出疑似菌落则重新取样分离，若存在则挑选平板上数个圆形、透明、边缘光滑、奶油状的菌落平板划线法在LB培养基上传代，于37℃CO2恒温箱中培养36 h～48 h以获得纯培养。

1.3 革兰染色取之前纯培养的菌做菌液，经涂片固定，做革兰染色。

1.4 生化试验鉴定挑取2组新鲜菌液按常规方法分别进行明胶液化试验、过氧化氢酶试验、氧化酶试验、糖发酵试验。

1.5 PCR方法的鉴定

1.5.1 PCR扩增根据GenBank中发表的鸭疫里默菌（RA）1-19型16S rRNA基因序列分别与大肠埃希菌等的16S rRNA基因序列比对设计特异性引物［4］：F：5′-CTGAACACGGTGTACGAATAAG-3′；R：5′-TCTTATACGAGTCCCCAAC-3′，片段大小680 bp。采用20μL体系：RA 16s rRNA F：0.5μL，RA 16 s rRNA R：0.5μL，DNA模板1μL（新鲜菌液），Premix Taq DNA聚合酶10μL，ddH2O补足20μL。PCR反应条件为94℃预变性5min，94℃变性30 s，58℃复性45 s，72℃延伸1min，30个循环，最后72℃温育8 min。凝胶电泳检测，取20μL PCR产物混合2μL 10 Loading Buffer在1%琼脂糖凝胶中进行电泳，另加5μL DL-2 000 DNA Marker作为标准，结果在凝胶成像系统中观察。

1.5.2 PCR产物的纯化与克隆PCR产物纯化及与质粒pMD18-T的连接分别参照试剂盒的说明书进行，连接后转化E.coli DH5α、筛选阳性克隆［5］。

1.5.3 重组质粒的鉴定将根据蓝白斑筛选原则筛选的阳性克隆接种于5 mL的LB液体培养基（含氨苄青霉素）中振荡培养后，取2 mL重组菌液，用SanPrep柱式质粒DNA小量抽取试剂盒抽提质粒，PCR后拍照鉴定，取经鉴定的重组菌液1 mL送上海生工生物工程技术服务有限公司进行核苷酸序列测定。

1.6 药敏试验按常规药敏纸片法测定2株分离菌株对头孢噻肟、丁胺卡那霉素等18种抗生素的敏感性。敏感度根据杭州天和微生物试剂有限公司提供的标准进行判定。

2 结果与分析

2.1 细菌分离培养获得纯培养菌落较小，呈圆形、透明、边缘光滑、奶油状，取纯培养菌做菌液，经涂片固定，做革兰染色，在油镜下观察到红色阴性小杆菌，单个或成对，少数呈丝状，无芽孢。

2.2 生化试验鉴定两株分离菌株不发酵糖类和醇类，不产生硫化氢，尿素酶和过氧化氢酶试验阳性（见表1）。因此，根据其形态学特征、培养和生化特性可初步确定为RA。

2.3 病鹅脑部分离菌株16s rRNA PCR扩增结果病鹅脑部两株分离菌株以16s rRNA设计引物时PCR扩增得都1条680 bp的特异性条带（见图

1），与预期结果相符。

表1 鸭疫里默菌分离菌株生化试验结果

2.4 目的基因克隆及重组质粒鉴定经鉴定阳性的菌株进行增菌培养，用SanPrep柱式质粒DNA小量抽取试剂盒抽取质粒DNA，经PCR鉴定，电泳检测，结果与预期一致（见图2）。

图1 PCR检测结果

2.5 序列测定及分析2株RA重组质粒样品测序后经BLAST进行序列分析，测序结果与Gen⁃Bank中收录的鸭疫里默菌基因序列进行比对，进一步证实为鸭疫里默菌序列。

图2 重组质粒PCR鉴定结果

2.6 药敏试验结果两株细菌（AH1、AH2）药敏试验结果为，AH1对头孢噻肟钠、硫酸丁胺卡那霉素高敏；对阿奇霉素中敏；AH2对强力霉素、壮观霉素高敏；对左氧氟沙星、新霉素中敏；而两株对氟苯尼考、庆大霉素、氨苄西林、洁霉素、链霉素、阿莫西林、磺胺间甲氧嘧啶、磷霉素、环丙沙星、罗美沙星、利福平等药物均不敏感。

3 讨论

3.1 对RA感染进行准确诊断必需依靠细菌的分离和鉴定。鉴定RA通常检测其培养特性、染色反应、生理生化特征、菌体的某些化学组成等表型指标，但RA常缺乏特定的表型特征和选择性的培养基［6］，仅依据表型却不足以对RA做出准确鉴定。因此，使用分子方法进行鉴定十分必要。本试验通过细菌分离、生理生化鉴定、16S rRNA分析，将生理生化特性测定与16S rRNA序列分析鉴定相结合，使鉴定结果更科学、更准确。

3.2 由于细菌的16S rRNA基因分子结构上的高度保守性，因此常用于对细菌的种属鉴定［7-9］。本试验通过对2株鹅源RA安徽流行株的16S rRNA基因扩增和序列分析，鉴定其是否属于鸭疫里默氏菌，所得到的序列通过比对，结果发现其与GenBank上发布的RA的16S rRNA的同源性达到99.98%。

3.3 药物敏感性试验中，2株鹅源里默菌对相同药物的敏感性不尽相同，与其他报道也不尽相同［10］，说明不同鸭群RA的分离株对同种药物表现出差异，药敏试验对临床用药治疗RA感染具有重要的意义。目前由于滥用抗菌类药物而导致耐药性日益严重，因此鹅场感染RA后，最好根据RA的药敏试验来进行治疗，避免因药物耐药性而造成更大的经济损失。

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S852.612

B

0529-6005（2015）12-0048-02

2015-02-12

国家现代农业产业技术体系项目（CARS-41）；安徽省农业科学院科技创新团队项目（11C0404）；国家自然科学基金项目（31302044）

胡晓苗（1971-），男，助理研究员，硕士，主要从事兽医微生物与免疫学研究，E-mail：huxiaomiao66@163.com

戴银，E-mail：daiyin2020@163.com