鹅细小病毒吉林株的分离鉴定及其全基因序列分析

孟繁兴，董 浩，胡振林，徐 浩，邵洪泽，胡桂学

（1.吉林农业大学动物科学技术学院，吉林长春130118；2.吉林农业大学生命科学学院，吉林长春130118；3.吉林省畜牧兽医科学研究院，吉林长春130062）

鹅细小病毒吉林株的分离鉴定及其全基因序列分析

孟繁兴1，董 浩2，胡振林2，徐 浩1，邵洪泽3，胡桂学1

（1.吉林农业大学动物科学技术学院，吉林长春130118；2.吉林农业大学生命科学学院，吉林长春130118；3.吉林省畜牧兽医科学研究院，吉林长春130062）

从患病鹅的病料中分离鉴定了2株鹅细小病毒（Goose parvovirus，GPV），命名为CH株和LS株。参考NCBI中多株GPV全基因序列，分段设计5对引物，对分离株的全基因序列进行PCR扩增、测序、拼接，并使用生物学软件对全基因序列进行比对和分析。遗传进化分析显示，CH株与LS株处于同一分支且相邻，表明具有较近的亲缘关系。由此推测，两株病毒可能起源于同一原始毒株。

鹅细小病毒；分离鉴定；全基因；序列分析

鹅细小病毒（Goose parvovirus，GPV）属于细小病毒科（Parvoviridae）细小病毒属成员，该病毒主要侵害3周龄内的雏鹅和雏番鸭的急性败血性传染病，常被称为小鹅瘟。鹅细小病毒最早是由方定一在扬州分离到［1］，随之欧洲10多个国家相继报道［2-4］。小鹅瘟传播快，死亡率高，在我国常年流行，给水禽养殖业带来巨大的经济损失。近年来，随着吉林省养鹅业的快速发展，小鹅瘟在吉林地区呈现局部流行的趋势。2012-2013年间，吉林省长春、梨树等地区均出现了疑似小鹅瘟的疫情，本研究从病鹅病料中分离鉴定了2株GPV，并对其的基因组全基因序列进行测定，对了解吉林省流行株GPV的基因特征、疾病防治及疫苗选用提供可靠依据。

1 材料与方法

1.1 病料及鹅胚来源病料来自吉林省长春、梨树地区2批发病雏鹅，由吉林农业大学动物医院提供。12～15日龄鹅胚来源于吉林农业大学动物科学技术学院吉林白鹅繁育场。

1.2 主要试剂DH5α大肠杆菌感受态，dNTP，Ex Taq酶，Ex Taq Buffer，pMD-18T试剂盒，EcoRⅠ和XhoⅠ限制性内切酶等，均购自TaKaRa公司；质粒小提试剂盒，购自OMEGA公司；DNA Gel Ex⁃traction Kit试剂盒，购自AXYGEX公司。

1.3 引物设计与合成鉴定引物：GPV F：5′-CCAAGCTACAACAACCACATCTAC-3′；GPV R：5′-CTGCGGCAGGGCATAGACATCCGAC-3′，该引物由吉林农业大学预防兽医学实验室提供，由上海生工生物工程技术服务有限公司合成，分装。参考NCBI上公布的GPV全基因序列设计了5对PCR引物，引物由上海生工生物工程技术服务有限公司合成，引物序列如下。P1：5′-CTCATTGGAGGGTTCGTTC⁃GTTCGAA-3′，P2：5′-GCATGCGCGTGGTCAACCTA ACAGCCGGAA-3′，P3：5′-GCATGCCGCGCGGTCAGCCCAATA-3′，P4：5′-TTCAGAATTTGATAGACCC TGTTCTTAGTTA-3′，P5：5′-CACCACTTACTTCCAA CAGAGCG-3′，P6：5′-CAGACTGAGACTGCTGGTTT GG-3′，P7：5′-TGTATTTGAATGTATGGAATGTGAGA-3′，P8：5′-TCAGCCTGTCTAAGTCGTGTG-3′，P9：5′-CATTGCAAACAATCTCACGTCAACGAT-3′，P10：5′-GGATCCACGGCACCCGTC-3′。

1.4 病毒的分离无菌采取病死雏鹅肝脏和小肠内容物放入十字匀浆器制备匀浆，除菌，常规方法接种鹅胚，无菌收集24～120 h死亡鹅胚尿囊液并盲传3代。

1.5 PCR检测以第3代鹅胚尿囊液作为模板，用鉴定引物进行PCR检测。反应体系如下：模板3μL，10×Ex Taq Buffer 5.0μL，dNTP（10 mmol/L）4.0μL，上/下游引物各0.5μL（10mmol/L），Ex Taq 0.5μL，ddH2O补足至25μL。反应条件均为：95℃10 min、95℃35 s、54℃45 s，72℃30 s，共40个循环，72℃延伸10min。PCR产物进行凝胶电泳检测，结果为阳性产物送往上海生工生物工程技术服务有限公司测序。

1.6 全基因分段PCR提取病毒DNA溶液为模板用于扩增GPV全基因的5个片段。PCR反应体系：DNA模板1μg，10×Ex Taq Buffer 5.0μL，dNTP（10mmol/L）4.0μL，P1/P2（P3/P4、P5/P6、P7/P8、P9/ P2）各0.5μL（10mmol/L），Ex Taq 0.5μL，dd H2O补足50μL。反应条件为：95℃10 min，95℃35 s，55℃45 s（片段2和3为58℃，片段4和5为60℃），72℃30 s，共30个循环，72℃延伸10min。1.7全基因各片段纯化及克隆5种PCR产物分别经琼脂糖凝胶电泳，并用AXYGEX的DNA回收试剂盒纯化。参照TaKaRa公司pMD-18T载体试剂盒说明书，取上述5种PCR胶回收纯化产物与pMD-18T载体进行连接，鉴定呈阳性的菌落接种LB培养基培养至混浊，提取质粒并进行质粒PCR鉴定。

1.8 序列测定及分析将PCR鉴定呈阳性的质粒送往上海生工生物工程技术服务有限公司进行测序。使用DNAStar生物学软件对所测得的序列和GenBank上发表的毒株（见表1）进行分析。

表1 主要参考毒株信息

2 结果

2.1 PCR鉴定分别取两份病料的第3代鹅胚尿囊液作为模板，PCR检测GPV。结果如图1所示，均在375 bp处出现特异性条带，与预期结果相符。

图1 GPV PCR鉴定结果

2.2 基因组分段PCR以第3代含GPV CH株和LS株尿囊液所提取的DNA溶液作模板用于扩增GPV全基因的5个片段，结果如图2所示，1～5大小分别约为180 bp、1 070 bp、1 350 bp、1 460 bp、1 660 bp的PCR产物，均符合预期结果。

图2 GPV全基因PCR结果

2.3 全基因序列分析GPVCH株和LS株经拼接后均为5 050 nt，末端回文序列（ITR）均为416 nt。VP蛋白均由1 844 nt编码，NS蛋白均由2 199 nt编码。CH株和LS株的ITR与NS蛋白之间都存在92 nt非编码区，NS和VP基因间也均存在18 nt的接头。CH株和LS株的末端回文序列（ITR）均长416 nt，并且高度同源，只相差3个碱基（157T/C、323A/C、349T/ C）。ITR位于NS基因和VP基因两端，均形成发夹样结构，其中还含有大量的4～10 nt重复序列。两端ITR长为416 nt，可折叠形成“U”形双链发夹结构，该结构中含有167 nt的无错配“茎”部和44 nt的“泡”区，外形如“箭”状，在箭头中间有一个序列为GCATGC的Sph I内切酶位点。

应用MegAlign软件分析GPV全基因的同源性，绘制表格（图3），从图表中可以看出，CH株和LS株具有很高同源性，为98.8%。CH株、LS株与SHFX1201株的同源性分别为99.6%和98.8%。制作系统进化树（图4），发现CH株与LS株处于同一分支上，且相邻，表明亲缘关系极其相近。此外，这2株与台湾地方分离株82-0321的亲缘关系较近。

图3 14株GPV全基因同源性

图4 14株GPV全基因进化树

3 讨论

随着养殖业的不断发展，养鹅业也在迅速的扩大，但小鹅瘟给养鹅业带来很大的经济损失，近年来不断有小鹅瘟的报道。本次吉林地区小鹅瘟疫情的暴发，可能是由于本地雏鹅供应不足，外地鹅只大量涌入，导致一些传染性疾病（包括小鹅瘟）传入。由于成年鹅的隐性带毒，检疫时不容易发现，这样外来的GPV就随着鹅只进入吉林省，短短几年内就可传变整个省。本试验对吉林地区疑似小鹅瘟死亡的病鹅进行病毒的分离与鉴定。结果分离鉴定得到2株GPV。针对全基因设计引物，克隆、测定全基因序列。经全基因序列比对分析发现，CH株与LS株的核苷酸同源性为98.8%，与上海SHFX1201株的核苷酸同源性分别为99.6%和98.8%遗传进行分析可知，这3株在进化树上分布相距较近，亲缘关系相对较近。由此推测，CH株、LS株与SHFX1201株可能源自同一原始毒株。上海SHFX1201株分离自2012年1月，而CH株、LS株均分离在这之后。上海和吉林地区同一时期内出现亲缘关系如此相近的毒株引起的小鹅瘟，说明它们的原始毒株分布广泛，可能在上海至吉林之间的这些省份均有存在；吉林地区的小鹅瘟病原可能是由上海传入的。

根据现有的14株GPVNS-VP基因初步判断，中国目前所分离的GPV毒株主要有2个基因特点，一是以5 050 nt为基本骨架，其代表毒株为YZ99-6株，其类似毒株有82-0321株、06-029株、SHFX1201株、CH株和LS株，其基因组全长约为5 050 nt，末端反向重复序列（ITR）在414～418之间。此基因类型中还包括不典型的ITR为444 nt或443 nt的安徽Y株和E株，全长为5 125 nt和5 104 nt。二是以5 106 nt为基本骨架，其代表毒株为SH株、SYG61V株。疫苗株GDaGPV株也属于此基因型，说明其种源毒也属于该类群。其全基因长5102～5106 nt，ITR为442～444 nt。国内鹅细小病毒的系统研究，尤其是分子流行病学调查方面的工作开展较少，大陆研究者更是很少对GPV全基因测序，导致病毒溯源的困难和GPV病毒基因分型的盲目，这给弱毒疫苗的研制带来一定的影响。所以对GPV全基因测序分析是有必要的，这对病毒的基因分型和疫苗的研制都有意义。

［1］方定一.“小鹅瘟”的介绍［J］.中国畜牧兽医，1962（08）：19-20.

［2］Hlinak A，Muller T，Kramer M，et al.Serological survey of viral pathogens in bean and white～fronted geese from Germany［J］.Jour⁃ nal ofWildlife Diseases，1998，34：479-486.

［3］Cough D，Ceeraz V，Cox B，et al.Isolation and identification of goose parvovims in the UK［J］.Veterinary Record，2005，26（3）：424-424.

［4］Irvine R，Ceeraz V，Cox B，et al.Goose parvovirus in Great Brit⁃ain［J］.Veterinary Record，2008，163（15）：461.

Isolation and Identification and W hole-genome Sequence Analysis of Goose Parvovirus Jilin Strains

MENG Fan-xing1，DONGHao2，HU Zhen-lin2，XU Hao1，SHAO Hong-ze3，HU Gui-xue1
（1.College of Animal Science and Technology，Jilin Agricultural University，Changchun 130118，China；2.College of Life Science，Jilin Agricultural University，Changchun 130118，China；3.Jilin Academy of Animal Husbandry and Veterinary Medicine，Changchun 130062，China）

In this study，we successfully isolated and identified two strains of Goose parvovirus（GPV）from samples of sick goose and named the two strains as CH strain and LS strain.Referred to whole-genome sequence ofmultiple strains of GPV in NC⁃BI，we designed five pairs of primers，and amplified the samples by PCR.Then，we sequenced thewhole-genome sequence of the isolated strains and used biology software to compare and analyze the whole-genome sequence.Phylogenetic analysis showed that CH strain and LS strain were in the same branch and next to each other，indicating that they have relatively closer genetic relation⁃ship.Thus，we infer that the two virusesmay be originated from the same original strain.

Goose parvovirus；Isolation and identification；Whole genome；Sequence analysis

HU Gui-xue

S852.65+9.2

A

0529-6005（2015）12-0033-03

2015-03-23

吉林省科技发展计划项目（20130522086JH）；高等学校博士学科点专项科研基金（20112223110002）；吉林省现代农业产业技术体系建设专项资金（201231）；吉林省教育厅科学技术研究项目（2015209）

孟繁兴（1984-），男，博士生，研究方向为鹅细小病毒研究，E-mail：281018379@qq.com

胡桂学，E-mail：huguixue901103@163.com