鸡源乳杆菌的分离鉴定及益生性能研究

韩亚超，刘朋明，张新红，何永高

（1.阜阳职业技术学院生化工程学院，安徽阜阳 236031；2.亳州师范高等专科学校，安徽亳州 236800；3.安徽江中高邦制药有限公司，安徽淮南232008）

自1928年抗生素发明以来，其用途越来越广泛，甚至已经达到了滥用的程度，尤其是在畜禽养殖业。尽管有关部门三令五申禁用某些抗生素，并对一些允许添加的抗生素要求严格限量。但是养殖业主为了减少畜禽的发病率和死亡率，不断在饲料中超标添加各种抗生素和激素。抗生素的滥用导致微生态失衡，大量耐药菌株不断产生，给人类的健康带来严重的威胁。食品安全尤其是畜禽产品的安全问题是摆在政府监管部门的一个难题，同时也是人们日常消费不得不去面对的问题。

益生菌制剂以其无毒、无残留、无耐药性、低成本，并能有效补充畜禽消化道内的有益微生物，调节肠道微生态平衡等优点，被认为是抗生素的理想替代品而使用[1]。乳杆菌(Lactobacillus)是动物机体内正常的生理菌群之一。乳杆菌可粘附于肠道粘膜细胞上,一方面对肠道粘膜有占位性保护作用,另一方面可刺激肠道局部的免疫反应。本研究从健康蛋鸡的肠道中分离了一株益生乳杆菌SL3菌株,并对其抑菌特性、肠道黏附能力及生物安全性等益生特性进行了研究。认为乳杆菌SL3菌株可作为微生态制剂的优良菌株使用。

1 材料与方法

1.1 材料

1.1.1 样品来源 健康的10周龄罗曼褐蛋鸡。

1.1.2 培养基和试验试剂配制 试验所使用的MRS培养基按照陈天寿的《微生物培养基的制造与应用》[2]配制；各种生化培养基和试验试剂均按照赵斌的《微生物学实验》[3]配制。

1.1.3 指示菌：大肠杆菌（E.coli）、金黄色葡萄球菌（S.aureus)、鼠伤寒沙门氏菌(S.typhimur ium)、溶壁微球菌(M.lysodeikticus)由华中农业大学微生物实验室提供；

1.1.4 试验所用试剂均为市售的分析纯。

1.1.5 试验所用主要仪器设备：离心机（Eppendorf 5415D）、高压细胞破碎机（JNBIO）、生物安全柜（BIOBASE BSC-1100IIB2-X）等。

1.2 方法

1.2.1 乳杆菌的分离 将健康的10周龄罗曼褐蛋鸡颈部放血处死，无菌操作刮取小肠黏膜1g，经稀释后涂布在MRS琼脂平板上,37℃培养48h后挑取大小、颜色、形状、边缘及在培养基表面位置各异的单菌落，并通过在MRS琼脂培养基上划线得到纯培养。经革兰氏染色镜检，挑选染色结果为G+的不产芽孢的杆状菌株,再次划线纯化并保存菌种。

1.2.2 形态学及生理生化鉴定 将挑选出来的菌种依次从形态、生理生化特性、代谢产酸等方面进行鉴定，具体方法参照《伯杰氏细菌鉴定手册(第八版)》[4]。

1.2.3 耐酸性试验 将培养24h的菌液接种于pH值分别为2.0、3.0、4.0、6.8（CK）的MRS液体培养基中，37℃分别处理1h、2h、3h，通过处理前后活菌计数结果计算出细菌存活率。

1.2.4 胆盐耐受性试验 将培养24h的菌液接种于胆盐浓度分别为0（CK）、0.05%、0.10%、0.20%、0.30%、0.40%的MRS液体培养基中，37℃处理3h后，平板菌落计数，筛选出对酸和胆盐耐受能力均较强的菌株进行后续相关试验。

1.2.5 抑菌试验 将指示菌大肠杆菌（E.coli）、金黄色葡萄球菌（S.aureus)、鼠伤寒沙门氏菌(S.typhimurium)、溶壁微球菌(M.lysodeikticus)培养物分别均匀涂抹在NB平板上, 用直径6mm无菌打孔器打孔并封底。将乳杆菌的24h发酵培养液在5000rpm离心5min,取上清液备用；将乳杆菌的24h液体培养液进行细胞破碎，取细胞破碎液备用；分别以发酵上清液、细胞破碎液、发酵培养液为实验样本，以MRS液体培养基为对照, 37℃培养16h,观察有无抑菌圈并测量其直径，每个样本重复3次,计算平均值。

1.2.6 抑菌物质的确定

1.2.6.1 酸性抑制作用实验 将乳杆菌SL3菌株培养24h的发酵上清液、乳酸和盐酸分别调节pH至4.5后, 以大肠杆菌（E.coli）、金黄色葡萄球菌（S.aureus)、鼠伤寒沙门氏菌(S.typhimurium)、溶壁微球菌(M.lysodeikticus)为指示菌,进行抑菌试验。

1.2.6.2 过氧化氢抑制作用实验 取经过氧化氢酶处理后的SL3菌株发酵上清液,以大肠杆菌（E.coli）、金黄色葡萄球菌（S.aureus)、鼠伤寒沙门氏菌(S.typhimurium)、溶壁微球菌(M.lysodeikticus)为指示菌,进行抑菌试验。

1.2.6.3 蛋白酶处理实验 在3份乳杆菌SL3菌株培养24h的发酵上清液中分别按照1mg/ml的量加入蛋白酶K、胰蛋白酶和木瓜蛋白酶，37℃处理1h，然后用各处理后的发酵上清液进行抑菌试验。

1.2.7 肠道黏附能力试验 菌种在含20μl/mL的3H胸腺嘧啶核苷NB培养基中,37℃厌氧培养48h。以实验室保存的Bacillus subtilisstain B9 为对照菌株, 37℃培养24h,其余操作均与试验菌株一致。将培养的细菌于4000rpm离心10min,用含0.1%(W/V)叠氮钠的HH(Hepes-Hanks, Buffer:10mmol/LHEPES,pH7.4)液洗涤后,悬浮在HH液中。将细菌的光密度调节至(1-2)×108CFU/mL。

刮取健康的10周龄罗曼褐蛋鸡肠道黏液，并参照Rinkinen等[5]的方法进行肠黏液糖蛋白的提取，于-20℃冰箱中保存备用。将含肠黏液糖蛋白的悬浮液于4℃解冻,用HH液稀释至0.5mg/mL。取100μl稀释样品于96孔培养板中,4℃下20 h。轻轻吸弃上液,用HH液洗涤培养板2次,除去未粘在培养板上的糖蛋白,取100μl已标记的细菌,加入到上述培养板中，37℃下1 h。轻轻吸弃上液,用HH液洗涤培养板2次,以除去未黏附的细菌。自然干燥后加入150μl闪烁液,在液闪仪上测定放射性强度CPMa,每个做3个重复,以牛血清白蛋白作为空白对照。另取标记过的细菌HH悬浮液100μl,经0.2μm微孔滤膜过滤,检测该膜的CPM值,记为CPM0。细菌的黏附率(%)=CPMa/CPM0×100%。

1.2.8 安全性试验 取1日龄的健康雏鸡60只，随机分为2组，每组30只，试验组雏鸡平均每日饮活菌1×1010个，持续饮活菌21日，观察雏鸡的精神状态及采食、排便等情况。

2 结果

2.1 乳杆菌分离和菌落形态观察

经厌氧培养48h后，从MRS平板上分离菌株78株，经过革兰氏染色后镜检，从中筛选出G+、无芽孢杆菌10株，分别编号为SL1-SL10。这10株菌的菌落特征为乳白色、圆形、表面光滑凸起、边缘整齐、直径0.5-2.0mm，菌体杆状,多排列成长短不一的链状,也有单个分散排列。

2.2 乳杆菌的生理生化鉴定结果

乳杆菌生理生化鉴定结果见表1。根据《伯杰细菌鉴定手册(第八版)》，初步判定所选的10株菌均为乳杆菌（Lactobacillus）。

表1 乳杆菌属菌株的鉴定Table 1 Identification of the Lactobacillus strains

2.3 乳杆菌的耐酸、耐胆盐筛选试验结果

乳杆菌的耐酸筛选试验结果见表2。根据表中的统计结果，挑选在pH2.0、耐受2h和耐受3h条件下，耐酸性较强的SL1、SL3、SL4、SL6、SL9进行了耐胆盐试验。

乳杆菌的耐胆盐筛选试验结果见表3。由表中可见，胆盐对乳杆菌的生长有明显抑制作用。随着胆盐浓度升高，5种乳杆菌菌株的存活率均呈现明显下降趋势,综合待测菌株对酸和胆盐的耐受情况，可知SL3菌株对酸和胆盐的耐受效果最佳，故选择SL3菌株进行后续的试验。

表2 不同pH值对乳杆菌存活率的影响Table 2 Effect of different pH values on the survival percentage of the Lactobacillus strains

表3 不同胆盐浓度对乳杆菌存活数的影响Table 3 Survival of the Lactobacillus strains in different concentrations of bile salt

2.4 乳杆菌抑菌试验

乳杆菌SL3菌株发酵培养液、发酵上清液、细胞破碎液分别对大肠杆菌（E.coli）、金黄色葡萄球菌（S.aureus)、鼠伤寒沙门氏菌(S.typhimurium)、溶壁微球菌(M.lysodeikticus)抑菌试验结果见表4。由表4得知,乳杆菌SL3菌株发酵培养液、发酵上清液、细胞破碎液均能对（E.coli）、金黄色葡萄球菌（S.aureus)、鼠伤寒沙门氏菌(S.typhimurium)、溶壁微球菌(M.lysodeikticus)具有良好的抑菌效果。且针对具体的某一种指示菌，乳杆菌SL3菌株发酵培养液、发酵上清液、细胞破碎液抑菌效果差异不显著。说明乳杆菌SL3菌株产生的抑菌物质应该是其释放到液体培养基中的代谢合成产物。故后续以乳杆菌SL3菌株发酵上清液作为抑菌样本，来研究其抑菌物质属性。

表4 Lactobacillus strain SL3对4种指示菌的抑制效果Table 4 Inhibitory of the Lactobacillus strain SL3 on four indicators

2.5 抑菌物质的确定

2.5.1 酸性抑制作用试验结果见表5。结果表明pH为4.5的乳酸和盐酸不能抑制指示菌的生长,而pH为4.5的菌株发酵上清液仍具有强烈的抑菌作用,说明排除酸性干扰后的发酵上清液中仍有抑菌活性物质存在。

表5 排除酸作用的抑菌试验结果Table 5 Results of antibacterial by supernatant without acid

2.5.2 过氧化氢抑制作用实验结果见表6。结果表明乳杆菌SL3菌株发酵上清液在排除了过氧化氢干扰后仍然具有较强的抑菌作用，说明在SL3菌株发酵上清液中主要抑菌作用的不是过氧化氢。

表6 过氧化氢酶处理后的抑菌试验结果Table 6 Results of antibacterial after treatment with hydrogen peroxidase

2.5.3 蛋白酶处理试验结果见表7。结果表明在使用胰蛋白酶、木瓜蛋白酶和蛋白酶K处理后的发酵上清液完全丧失抑菌活性, 说明SL3菌株的发酵上清液中的抑菌物质是一种蛋白质或多肽。

根据以上酸性抑制作用、过氧化氢抑制作用实验和蛋白酶处理试验结果,说明SL3菌株发酵产生的抑菌物质是一种类细菌素。

表7 蛋白酶处理后的抑菌试验结果Table 7 Results of antibacterial after treatment with protease

2.6 乳杆菌的黏附能力测定试验结果

试验菌种在肠黏液糖蛋白上的黏附率见表8。由表8可知,乳杆菌SL3菌株的黏附率明显高于枯草芽孢杆菌B9株在肠黏液糖蛋白上的黏附率,黏附性相对较好。

表8 乳杆菌SL3菌株和枯草芽孢杆菌B9株在肠黏液蛋白上的黏附率Table 8 Glycoprotein adhesion ratios of Lactobacillus strain SL3 and Bacillus subtilis strain B9

2.7 乳杆菌的安全性试验

通过21日的雏鸡饲喂试验，观察试验雏鸡采食、排便均正常，精神状态良好，生长发育正常，所有试验雏鸡没有发生死亡现象，说明分离获得的乳杆菌SL3菌株具有良好的生物安全性。

3 讨论

益生菌的菌株益生活性具有较强的针对性和特异性,即使其被制作成活菌制剂后也有一定的专一性，因此本研究直接从健康的蛋鸡肠道中进行乳杆菌的分离。由于乳杆菌不产芽孢,对环境的抗性较差,不易通过胃酸和胆汁环境，因此在进行乳杆菌的筛选时,模拟了宿主体内低pH值、高胆盐浓度的环境,筛选出了具有较强抗逆性的菌株SL3。

由于乳杆菌发酵培养液、细胞破碎液、发酵上清液均能对指示菌具有抑制作用，且差异不显著，那么其抑菌物质可能为乳杆菌合成的类细菌素，也有可能是代谢的乳酸或乙酸等酸性产物，为排除酸性产物的影响，本研究做了酸性抑制作用实验；为排除除过氧化氢的干扰对试验的影响，本研究进行了过氧化氢抑制作用实验。试验结果表明:抑菌物质并非乳酸或乙酸等酸性物质，同时也排除了过氧化氢的干扰，实验结果与李明雄[6]等人研究结论相同。并通过蛋白酶处理实验进一步说明的研究分离的乳杆菌SL3菌株的抑菌物质为类细菌素。

通过抑菌试验及黏附能力测定、雏鸡安全性试验,证明所筛选的乳杆菌SL3菌株不仅具有较好的抑制致病性细菌的能力和肠黏膜黏附能力,而且具有良好的生物安全性,具有进一步制备成优质、高效活菌微生态制剂的开发条件。

[1]何明清,倪学勤.我国动物微生态制剂研究、开发和应用动态[J].饲料广角,2002（21）:1-7.

[2]陈天寿.微生物培养基的制造与应用[M].北京:中国农业出版社,1995:33-34.

[3]赵斌,何绍江.微生物学实验[M].北京:科学出版社,2002:143-159.

[4]R·E布坝南,N·E吉本斯等著.中国科学院微生物研究所《伯杰氏细菌鉴定手册》翻译组译.伯杰细菌鉴定手册[M].北京:科学出版社,1984,793-820.

[5]Rinkinen M,Westermarck E,Salminen S,etal.Absence of host specificity for in vitro adhesion of probiotic lactic acid bacteria to intestinal mucus[J].Veterinary-Microbiology,2003(97):55-61.

[6]李明雄等.动物乳杆菌的分离鉴定及其抑菌蛋白的特性分析[J].微生物学通报，2009, 36(7):1001-1007.