宫瘤消胶囊对子宫肌瘤大鼠子宫平滑肌血管内皮生长因子及其受体表达的影响

李 楠 贺丰杰 李小宁 朱虹丽 陈 梅

(陕西中医药大学附属医院妇科，咸阳市 712000，E－mail:linan_80_311@163.com)

迄今为止子宫肌瘤发生的确切病因尚未明了，但雌、孕激素在其发生过程中的作用已得到广泛认可。有研究表明雌孕激素通过介导局部血管生长因子调控血管通透性及血管生成来促进肌瘤的生长并导致临床症状的出现［1－6］。血管内皮生长因子(vascular endothelial growth factor，VEGF)是主要的血管生成促进因子，在子宫肌瘤组织的血管生成中起着核心作用。笔者前期实验已证实宫瘤消胶囊能够调节雌、孕激素水平，影响靶器官中雌激素受体、孕激素受体的含量，抑制靶细胞对性激素的反应。目前，宫瘤消胶囊发挥抑瘤、缩瘤及预防复发的作用是否与调控VEGF 及其受体的表达有关尚无定论。本文旨在探讨宫瘤消胶囊对子宫肌瘤模型大鼠VEGF 及其受体表达的影响。

1 材料与方法

1.1 材料与实验动物

1.1.1 药物与试剂:宫瘤消胶囊［山东步长神州制药，批号131107;组成:牡蛎、香附(制)、三棱、莪术、土鳖虫、仙鹤草、党参、白术、白花蛇舌草、牡丹皮、吴茱萸;规格0.5 g/粒，20 粒/板，3 板/盒］、桂枝茯苓胶囊(江苏康缘药业股份有限公司，批号:130907;组成:桂枝、茯苓、牡丹皮、桃仁、白芍;规格:0.31 g/粒，10 粒/板，6 板/盒)、苯甲酸雌二醇(赤峰博恩药业，批号140201;规格:4 mg×10 支)、黄体酮注射液(浙江仙琚制药，批号140116.1;规格1 ml:20 mg×10支);VEGF、VEGF 受体1(vascular endothelial growth factor receptor 1，VEGFR1)、VEGF 受 体2(vascular endothelial growth factor receptor 2，VEGFR2)单克隆抗体(批号:bs－1665R，bs－1774R，bs－1932R)，购自博奥斯公司;聚偏二氟乙烯膜、辣根过氧化酶标记二抗(K－5007)购自Dako公司;二喹啉甲酸蛋白定量试剂盒购自凯基公司。

1.1.2 实验动物:清洁级雌性SD 大鼠60 只，未经生育交配，体重(200.0±20.0)g，购自第四军医大学实验动物中心，合格证号:SCXK(军)2012－0007。饲养环境:陕西中医药大学中药药理实验室，室温(20.0±2.0)℃，动物自由摄食、饮水，普通饲料喂养。

1.2 方法

1.2.1 大鼠子宫肌瘤模型的建立与分组:大鼠适应性喂养1 周后，按随机数字表法分为正常对照组、模型组、桂枝茯苓组和宫瘤消小剂量、中剂量、大剂量组，每组10只。模型组、桂枝茯苓组和宫瘤消小剂量、中剂量、大剂量组腹腔注射苯甲酸雌二醇注射液0.5 mg/kg，连续25 d，后改为腹腔注射黄体酮注射液4 mg/kg，连续5 d，即可建立子宫肌瘤模型。正常对照组腹腔内注射灭菌花生油0.5 mg/kg，连续30 d。

1.2.2 处理方法:正常对照组和模型组每日灌以生理盐水，10 ml/kg，各组均1 次/d。宫瘤消胶囊成人用量为0.5 g/粒，每日3 次，每次4 粒;桂枝茯苓胶囊成人用量为0.31 g/粒，每日3 次，每次3 粒。桂枝茯苓胶囊组按照70 kg 体重成人与大鼠体表面积折算的等效剂量，大鼠的等效剂量相当于成人的6.3 倍，0.25 g/kg 为该组每只大鼠每日灌胃总生药量，以10 ml/kg的标准计算出每只大鼠每日灌胃总体积，以此体积的生理盐水溶解总生药。宫瘤消小剂量组:按照上述方法，计算出0.54 g/kg 为每日总剂量，相当于临床剂量。宫瘤消中剂量组:按照上述方法，计算出1.35 g/kg 为每日总剂量，相当于临床剂量的2.5 倍。宫瘤消大剂量组:按照上述方法，给予宫瘤消胶囊剂量3.38 g/kg 为每日总剂量，相当于临床剂量的6.25 倍。造模结束后2 d，开始灌胃给药，1 次/d，连续4周。各组大鼠于灌胃给药干预后第4 周末分别脱臼处死动物，进行相关检测。

1.2.3 子宫组织细胞超微结构观察:处死大鼠后，剖腹沿子宫膀胱连接处剪取子宫，剥离洗净，在子宫最膨大处取0.5 ～1.0 mm3大小子宫平滑肌，1%锇酸固定2 h，逐级酒精脱水，将标本置于2%的乙酸异戊酯中3 h，干燥，采用电子显微镜(日立H－7650)观察子宫组织细胞超微结构。

1.2.4 Western Blot 法 检 测 子 宫 平 滑 肌 VEGF、VEGFR1、VEGFR2 的表达:子宫病理组织取材后，从子宫根部选取一段新鲜病变组织0.5 ～1.0 mm3(正常对照组取子宫相同部位等量正常组织)。将组织标本剪碎，经预冷的磷酸缓冲盐溶液洗涤2 次，加入1 ml 总蛋白质提取液，匀浆，振摇冰浴30 min，应用低温高速离心机，保持4℃，15 000 r/min 离心20 min，将上清液吸出后置入干净环氧树脂管，－30℃保存。取50 μl 上清液按BCA 蛋白测定试剂盒测定蛋白含量。样品煮沸3 min。取50 μg 总蛋白的样品液，进行聚丙烯酰胺凝胶电泳电泳;电泳完成后进行电转膜;转膜结束后进行膜封闭和一抗、二抗孵育。聚偏二氟乙烯膜通过电化学发光法显色，最后曝光于X 胶片上，常规显影、定影。内参照为鼠抗人甘油三磷酸脱氢酶单抗(1 ∶5 000)。结果扫描保存至电脑，经采用Quantity One 软件进行对特异蛋白条带进行灰度扫描和定量分析处理，得出相对光密度值。

1.3 统计学分析 采用SPSS 17.0 软件进行统计分析，计量资料以表示，多组均数比较采用方差分析，两两比较采用LSD 法，以P ＜0.05 为差异有统计学意义。

2 结 果

2.1 各组大鼠子宫组织细胞超微结构观察 正常对照组子宫平滑肌细胞排列整齐，呈梭形，胞质内细胞器正常，相邻细胞连接紧密，细胞周围胶原纤维排列规则，见图1。模型组子宫肌瘤细胞显著增生，体积增大;细胞核近似椭圆形，核体积增大，核仁较大;细胞内含有较丰富的肌微丝，线粒体增生，数目增多，粗面内质网扩张;细胞周围可见大量增生、排列不规则的胶原纤维，见图2。桂枝茯苓组细胞排列稀疏，轻度增生，核质比例失调，细胞器减少，胞质内线粒体轻度肥大增生，可见少量核糖体和扩张的粗面内质网，细胞周围胶原纤维紊乱、堆积，见图3。宫瘤消小剂量组细胞排列较稀疏，轻度增生，肌微丝不丰富，胞质内细胞器减少，线粒体和扩张的粗面内质网较少，部分线粒体呈空泡样改变，细胞周围胶原纤维度轻度增生、排列紊乱，见图4。宫瘤消中剂量组细胞排列基本正常，体积略缩小，肌微丝较丰富，胞质内细胞器增多，见线粒体和扩张的粗面内质网，部分线粒体呈空泡样改变，空泡较多，细胞周围胶原纤维增生不明显、排列较规则，见图5。宫瘤消大剂量组细胞排列基本正常，体积缩小，部分核固缩，染色质边集;细胞器基本接近正常，肌微丝含量较少，线粒体数目减少;胶原纤维增生不明显，排列基本规则，见图6。

2.2 各组大鼠子宫平滑肌VEGF、VEGFR1、VEGFR2 的表达情况 各组大鼠子宫平滑肌VEGF、VEGFR1、VEGFR2的表达水平比较，差异有统计学意义(P ＜0.05)。除宫瘤消大剂量组VEGFR2 表达水平均高于正常对照组(P ＞0.05)外，模型组、桂枝茯苓组及宫瘤消各剂量组VEGF、VEGFR1、VEGFR2 的表达水平均高于正常对照组(P ＜0.05)。与模型组比较，宫瘤消小剂量组VEGFR2与之比较仅有下降趋势，差异无统计学意义(P ＞0.05)，宫瘤消各剂量组VEGF、VEGFR1、VEGFR2 的表达水平均明显低于模型组(P ＜0.05)。桂枝茯苓组除了VEGFR2的表达水平低于模型组(P ＜0.05)外，VEGF、VEGFR1的表达水平与模型组比较，差异均无统计学意义(P ＞0.05)。宫瘤消小剂量组VEGFR2 的表达水平与桂枝茯苓胶囊组比较，差异无统计学意义(P ＞0.05)，各剂量宫瘤消组VEGF、VEGFR1、VEGFR2 的表达水平均明显低于桂枝茯苓组(P ＜0.05)。见表1。

图1 正常对照组子宫组织细胞超微结构(×8 000)

图2 模型组子宫组织细胞超微结构(×8 000)

图3 桂枝茯苓胶囊组子宫组织细胞超微结构(×8 000)

图4 宫瘤消小剂量组子宫组织细胞超微结构(×8 000)

图5 宫瘤消中剂量组子宫组织细胞超微结构(×8 000)

图6 宫瘤消大剂量组子宫组织细胞超微结构(×8 000)

表1 各组大鼠子宫平滑肌VEGF、VEGFR1、VEGFR2 的表达情况，ng/L)

表1 各组大鼠子宫平滑肌VEGF、VEGFR1、VEGFR2 的表达情况，ng/L)

注:与正常对照组比较，#P ＜0.01，与模型组比较，*P ＜0.01。

组别 nVEGF VEGFR1 VEGFR2宫宫宫正 桂瘤瘤瘤常模枝消消消对型茯小中大照组苓剂剂剂组 组量量量 组组组 111111 000000 000 00 0.....321.440167 60 9±±±±±±000 00 0.....000.000745 41 3###***##000 00 0.....321.440298 00 9±±±±±±000 00 0.....000.00864 0619#####*** 00 000 0.....1.1 3337 0 0 846 8±±±±±±00 000 0.....0.0 000 0 12 616 1#*###*F 值 204.053 40.898 140.419 P 值 ＜0.001 ＜0.001 ＜0.001

3 讨 论

子宫肌瘤为女性生殖系统最常见的良性实体肿瘤，其发生发展是一个多因素参与的过程，其病因错综复杂，涉及种族、性激素、生长因子、癌基因等多个环节。虽然病因尚未明确，但目前已公认子宫肌瘤是性激素依赖性肿瘤，雌激素、孕激素与其受体之间的相互作用是子宫肌瘤生长的基础和促进因素。因此，本研究采用外源性雌孕激素负荷法制造大鼠子宫肌瘤动物模型。通过电镜观察到正常对照组大鼠子宫平滑肌细胞排列整齐，胞质内细胞器正常，胶原纤维排列规则;模型组大鼠子宫平滑肌细胞增生、体积增大，细胞内有丰富的肌微丝，细胞器数量增多，胶原纤维增生紊乱，提示模型组大鼠子宫肌层病理变化与人子宫肌瘤病理组织学结构类似，证实了模型复制成功。在给予不同剂量宫瘤消胶囊治疗后，病理学结果显示，平滑肌细胞的异常增殖受到抑制，部分胶原纤维的紊乱堆积情况得到逆转。提示宫瘤消胶囊能有效改善雌、孕激素负荷大鼠子宫组织细胞超微结构改变。

足够的血流供应及血管生成是肿瘤生长的必要条件，子宫肌瘤的生长同样需要丰富的血供及血管形成。在各种肿瘤中均发现VEGF 的存在，无论是在体内还是体外研究中，VEGF 均被证实参与了肿瘤血管生成活动。VEGFR1 与VEGFR2 作为与VEGF 特异性结合的受体，是受体酪氨酸激酶家族中的主要成员，两者与配体结合后能促进内皮细胞分裂增生及新生血管的形成，增加血管通透性，促进可溶解血管基底膜和间质纤维酶的表达，有利于新生血管的生长［7］。

在既往的研究中，有关VEGF 及其受体在子宫肌瘤发生中的作用报告较少。Harrison－Woolrych 等［8］通过PCR 技术发现瘤体平滑肌细胞中有VEGF mRNA 及VEGF 肽表达。随后Hague 等［9］通过试验将VEGF 表达进行定位，发现在子宫肌瘤瘤体的内皮细胞、血管平滑肌细胞以及平滑肌细胞中VEGF 呈现高表达。此后钟一村等［10］通过对人子宫肌瘤中VEGF 及其受体表达的研究，发现VEGF、VEGFR1 与VEGFR2 蛋白在肌瘤组织中的表达明显高于周围正常肌层组织，并且在整个月经期都发挥着相同的作用，其表达量与肌瘤数量呈正相关。这些研究不但证实了VEGF、VEGFR1 与VEGFR2与肌瘤的发病密切相关，也揭示了与肌瘤病变程度的内在联系。

本文结果显示，与模型组比较，除宫瘤消小剂量组VEGFR2 表达水平与模型组比较差异无统计学意义(P ＞0.05)外，宫瘤消各剂量组VEGF、VEGFR1、VEGFR2的表达水平均明显降低(P ＜0.05)，说明宫瘤消胶囊干预后，VEGFR1 与VEGFR2 的表达水平与VEGF 同步降低，这提示VEGFR1、VEGFR2 与VEGF 的表达水平相适应，对肌瘤的发病同样具有重要作用。这种抑制效应提示中药宫瘤消胶囊抑瘤、缩瘤、预防复发的作用与干扰VEGF/VEGFR 信号系统从而抑制内皮细胞增生、新血管形成，降低血管通透性，减少甚至阻断子宫肌瘤血供，进而使瘤细胞萎缩或消亡有关。本文结果提示，小剂量宫瘤消组的VEGFR2 表达水平与模型组比较，差异无统计学意义(P ＞0.05)，提示其对VEGFR2 的抑制作用相对微弱，这反映了VEGFR2 的表达更活跃，可能对肌瘤的生长起到更大的作用，与肌瘤病变程度的内在联系更紧密。随着剂量的增加，宫瘤消胶囊对VEGFR2 的表达水平逐渐表现出显著的降调节效应。其中，宫瘤消胶囊大剂量组对VEGFR2 的作用更为突出，数据显示该组的VEGFR2表达水平接近正常对照组的水平。这为宫瘤消胶囊抑瘤、缩瘤的最低有效剂量的确定提供了参考。

综上所述，宫瘤消胶囊对子宫肌瘤模型大鼠VEGF及其受体表达有明显抑制作用，并能改善子宫肌瘤细胞超微结构。干扰VEGF/VEGFR 信号系统从而抑制内皮细胞增生、新血管形成，降低血管通透性，减少甚至阻断子宫肌瘤血供，进而使瘤细胞萎缩或消亡可能是宫瘤消胶囊抑瘤、缩瘤、预防复发的机制之一。

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［10］钟一村，李卫平，丁传伟.血管内皮生长因子及其受体在子宫肌瘤发病中的作用的研究［J］.中国实用妇科与产科杂志，2008，24(3):207－209.