HMGB1基因蛋白特性及抑制剂研究进展

丁军颖，刘清泉

高迁移率族蛋白(high mobility group，HMG)是Goodwin Johns在小牛胸腺中发现的，分子量＜30 KD，含高比例带电氨基酸，电泳时迁移率高，并因此得名。国际学术机构将HMG分为HMGB1、HMGB2和 HMGB3，三者氨基酸序列一致性达80%。HMG几乎表达于所有类型的组织细胞，胚胎组织尤为丰富。以一种与序列无关的方式结合在DNA上，对染色体重组非常重要，是C末端重复序列中两个氨基酸残基被置换［1］，并有维持核小体结构、调节基因转录、稳定染色质和参与DNA重组等功能。

1 HMGB1的蛋白及基因结构

HMGB1是HMG家族中含量最丰富的蛋白，平均每10～15个核小体中即含1个HMGB1。由215个氨基酸构成，在不同物种之间具备高度保守性，人与鼠氨基酸序列同源性高达99%;大鼠与小鼠蛋白序列完全一致。人的HMGB1基因位于13q12染色体上，含TATA盒启动子及数个转录因子结合位点——两个同源的L型DNA结合区(A盒和B盒，约75个氨基酸)及含天冬氨酸与谷氨酸多重复序列的C末端:①A盒和B盒均由3个螺旋组成，带正电，是HMGB1的非特异性DNA结合区，广泛识别并结合DNA，通过改变构象与DNA结合蛋白精确装配，实现调节DNA修复、重组和基因转录调控等功能［2-3］。②B盒是引起炎性反应的功能结构域，能刺激鼠巨噬细胞株(RAW264．7)释放肿瘤坏死因子 α(TNF-α)，甚至致小鼠死亡［4］。已证实，含TNF-α在内的细胞因子与HMGB1的作用区域是B盒DNA结合域的前20个氨基酸残基区(HMGB1 aa89 ～108)［5］;小鼠接种抗 HMGB1 B 盒抗体对盲肠结扎穿孔诱导的重度脓毒症有明显保护作用［4］，提示HMGB1 B盒可能是治疗脓毒症的靶点。③A盒位于序列末端，进化高度保守，可竞争性抑制HMGB1致炎功能，类似全长HMGB1抗体的功能，对B盒有拮抗作用。④C末端是HMGB1结合受体的部位，通过与其他蛋白相互作用调节核内HMGB1与DNA的亲和力，实现相关生物学功能。⑤另外，HMGB1序列中存在一个与A盒和B盒结构域同源的DNA结合基元，即HMG盒，既可提供与DNA二级结构特异的结合位点，以非序列依赖方式疏松结合于DNA小槽内;也可提供非特异性DNA结合位点，是辨认和结合变形DNA所必需的结构［6］。

2 HMGB1的释放方式

HMGB1几乎表达于所有细胞。在肝、脑组织细胞中，HMGB1表达于胞质中;在其他组织细胞，多存在于胞核内。正常生理情况下，HMGB1定位于核内，表达量维持在基础水平;受刺激后赖氨酸残基发生乙酰化修饰，促进HMGB1核浆转移，并阻止其重新进入胞核。其释放方式主要有两种:被动释放和主动分泌［7］。

2.1 被动释放 在凋亡细胞中，HMGB1因组蛋白广泛去乙酰化而与DNA紧密结合，使其存留于凋亡小体内而不被释放至胞外，但当被单核巨噬细胞吞噬后，发生二次坏死或组蛋白去乙酰化被阻断，HMGB1则被动释放至胞外。

2.2 主动分泌 HMGB1可由不同细胞主动分泌——活化的单核巨噬细胞、树突状细胞和自然杀伤细胞等。HMGB1因缺乏引导肽结构而不能以高尔基体/内质网途径分泌，需通过非经典途径——溶酶体分泌至胞外。已证实，HMGB1蛋白转录翻译后可广泛进行修饰——糖基化、乙酰化、甲基化和磷酸化等，其中，乙酰化和磷酸化均能诱导活化细胞主动分泌HMGB1。

值得注意的是由凋亡细胞被动释放与活化免疫细胞主动分泌的HMGB1在分子修饰方面有明显差异，后者表现为高乙酰化;不同释放方式的HMGB1蛋白因结构不同而功能不同——凋亡细胞释放的HMGB1具有诱导免疫耐受作用，而主动分泌的HMGB1则发挥促炎效应［8］。另据报道，单纯HMGB1无致炎活性，而与ssDNA、脂多糖和核小体等形成复合物后则有高致炎性——可分别激活Toll样受体9(TLR9)、TLR4 和 TLR2［9］，提示存在两种HMGB1分子形式，且二者作用亦不同。

3 HMGB1的生物学特性

3.1 核内HMGB1 核内HMGB1在DNA复制和基因转录中起重要作用。DNA复制时HMGB1作为基因调控蛋白，可避免DNA碱基错配;转录时，与不同结构DNA非特异性结合，促其局部空间构象变化，使不同转录因子与其结合，从而改变其基因表达。

3.2 胞外HMGB1 胞外HMGB1与核内HMGB1有不同的生物学功能。通过与受体RAGE、TLR2和TLR4等结合可激活胞内信号，不仅对自身分泌有级联放大效应，还可调节其他炎性因子、血管黏附分子和细胞趋化因子等的分泌，对炎性反应的发生、发展和维持起重要作用，是炎性细胞因子网络的核心。

3.2.1 炎性因子:胞外HMGB1作为炎性介质因子可激活巨噬细胞、单核细胞和内皮细胞等，使其表达释放巨噬细胞炎性蛋白-1β、白介素(IL)-6、IL-8、TNF-α、细胞间黏附分子-1(ICAM-1)和血管细胞黏附分子-1(VCAM-1)等，且这些因子多可与HMGB1相互诱生［1］，形成炎性环路，激发免疫炎性反应的同时，维持慢性炎症的持续过程，尤其在炎症晚期HMGB1可参与创伤脓毒症多器官损害及内毒素致病过程。

3.2.2 黏附因子:HMGB1也是单核细胞黏附和穿越内皮细胞的调节因子。单核细胞被激活后分泌HMGB1至细胞表面，与晚期糖基化终末产物受体(RAGE)结合，调节单核细胞迁移、黏附和游出;还可诱导内皮细胞表达 ICAM-1、VCAM-1、E-选择素(E-Selectin/CD62E)和RAGE，从而调节和放大单核细胞的免疫应答。

3.2.3 凝血因子:HMGB1还可诱导内皮细胞释放纤溶酶原激活物抑制因子-1(PAI-1)和组织纤溶酶原激活物(t-PA)，在机体凝血－抗凝血的平衡中发挥作用，参与炎性组织的血栓形成和弥散性血管内凝血过程［10］。

3.2.4 趋化因子:HMGB1还可与细胞表面趋化因子CXCL12结合，促进趋化因子受体(CXCR4)构象重排和炎性细胞转移，从而发挥促炎效应［11］。

3.2.5 信号转导因子:HMGB1还可介导核因子κB(NF-κB)等信号转导因子的激活，广泛参与机体各类炎性免疫反应［12-13］。

总之，胞外HMGB1可通过与炎性细胞因子、黏附和趋化因子等相互作用，在系列病理生理过程中发挥调节功能。当然，机体为了维护内环境稳定，染色体6q21基因编码的膜糖蛋白(CD24)和内皮细胞因子(TM)等多种HMGB1负调节受体也参与机体调节反应，起抑制炎性反应的作用。

4 HMGB1的受体及重要信号分子

4.1 RAGE HMGB1可与受体 RAGE、TLR4、TLR2和TLR9等结合。其中，RAGE具有很高的亲和力［14-15］，是最早被鉴定的受体。1992年首次从胎牛肺内皮组织中分离得到，分子量35 KD。人RAGE基因位于6p21．3，含有11个外显子，其原始翻译产物含404个氨基酸，属跨膜蛋白，包括胞外域、跨膜区和胞内域。其中，胞外域为配体结合部位，由321个氨基酸残基组成，含V及两个C型片段的免疫球蛋白样结构。V区是配体结合区，可介导相关免疫应答效应。RAGE是免疫球蛋白超家族的一员，可广泛表达于免疫细胞和活化的内皮细胞等［14-15］。一般RAGE为低表达，当炎症发生时，其配体(如HMGB1)表达增多，RAGE可随之表达上调。HMGB1与 RAGE结合，可通过活化 Rho族蛋白Ras/Raf、Rac/CDC42、c-Jun 氨基末端激酶(c-Jun N-terminal kinase，JNK)及其相关蛋白p38抗体(p38)等触发胞内信号级联反应，最后激活NF-κB信号通路，促进机体免疫炎性反应的发生和维持。

4.2 TLR 人类TLR家族成员现已确认的有10个(TLR1～10)，是HMGB1除RAGE外的另一类主要受体，包括TLR2、TLR4和TLR9等。TLR蛋白由胞外区、胞质区和跨膜区构成，通过胞外区可识别配体——外源性病原微生物成分，如脂多糖及部分机体内源性分子［16］。TLR介导的NF-κB通路现已基本明确:HMGB1与TLR结合，活化髓样分化因子MyD88和髓样分化因子接头样蛋白，进而激活下游IL-1受体相关激酶(IRAK-1，IRAK-2，IRAK-3/M，IRAK-4)，IL-1受体相关酶再与TNF-α、受体相关细胞因子-6和三联复合物(由转化生长因子激酶-1、转化生长因子激酶-1相关蛋白-1及转化生长因子和激酶-1相关蛋白-2组成)结合，而后复合物发生磷酸化，激活NF-κB抑制酶信号小体，释放 NF-κB，促进 TNF-α、IL-1、IL-6、IL-8 等促炎细胞因子的表达和释放，形成多米勒骨牌效应，即通过正反馈作用使炎性反应放大并维持。当缺失髓样分化因子或抑制TLR2活性时，HMGB1与DNA的结合通过RAGE/TLR9途径，HMGB1与核小体的结合则通过TLR2受体［17］。当 TLR2、TLR4和 RAGE 都被阻断时，HMGB1刺激巨噬细胞仍有低水平的 NF-κB活性［18］，提示存在其他未知的 HMGB1受体及通路，有待进一步研究证实。除了RAGE和TLR受体外，可能还存在其他受体与HMGB1信号传导途径相关，这被相应抗体只能阻断HMGB1部分功能所证实。

5 抑制剂

基于HMGB1的特性和活化通路的研究，起负调节作用的抑制剂逐渐被关注。

5.1 受体型抑制剂 通过与HMGB1结合负性调节HMGB1的刺激活性，如胞膜上的CD24、血栓调节蛋白、抗 HMGB1抗体、抗 RAGE抗体、分泌型RAGE(sRAGE)、涎免凝集素受体复合物、凝血酶敏感素、CXCL12抑制剂和甘草素等［19］。

5.2 抑制HMGB1释放的抑制剂 丙酮酸乙酯可抑制HMGB1释放，有抗炎作用［20］;小檗碱能明显抑制脂多糖激活的小鼠腹腔巨噬细胞释放HMGB1［21］;双环醇也可抑制 HMGB1 释放，进而下调 NF-κB 和蛋白 P65 的磷酸化［22］。

5.3 抑制HMGB1表达的抑制剂 没食子儿茶素在盲肠结扎穿刺导致的小鼠败血症模型中，能抑制HMGB1表达［23］;小檗碱能明显抑制脂多糖激活后小鼠腹腔巨噬细胞HMGB1 mRNA的表达［21］。

5.4 抑制HMGB1核浆转移的抑制剂 烟碱能通过与胶质细胞α7 nAChR特异结合而影响HMGB1从核内向核外转移［24］。芍药苷也有抑制HMGB1核浆转移的功效［25］。大黄素则对 LPS激活后RAW264．7细胞中 HMGB1的释放、mRNA表达和蛋白核浆转移均有抑制作用［26］;另外，具有抑制HMGB1活性或释放作用的还有HMGB1 A盒蛋白、正丁酸钠、胎球蛋白、槲皮素、顺铂、抗凝血酶Ⅲ及中药成分如丹参酮或小檗碱等［27］。

综上所述，HMGB1的受体 RAGE、TLR2和TLR4等分子可介导HMGB1参与免疫应答，其抑制剂则可通过不同环节阻抑或影响HMGB1的生物学功能。目前围绕HMGB1受体和抑制剂的相关信号通路尚不完全明晰，值得进一步探索。

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