γ干扰素释放试验与结核菌素试验对菌阴肺结核的诊断价值

崔 丹，赵 杰，李志惠

我国是结核感染高发国家，每年约25万人死于结核病，是其他各类传染病死亡人数的2倍［1］。临床上很多肺结核患者起病隐匿，无典型临床症状。目前，作为诊断肺结核的有效指标为病原学检测，然而抗酸染色检出率很低，结核菌培养耗时太长，故而临床上仍有很多菌阴肺结核患者被误诊或漏诊。结核菌素皮肤试验(tuberculin skin test，TST)是多年来一直沿用的诊断结核分枝杆菌感染的方法，在我国，仍作为辅助诊断菌阴肺结核的重要指标之一。但由于其抗原纯蛋白衍生物(purified protein derivative，PPD)与卡介苗的抗原成分有某些相同导致其特异性差，且TST检测与人体免疫功能密切相关，在人体免疫功能低下时其敏感性大大降低［2］。因此，提高肺结核的诊断率需要更为快速、有效的免疫学指标。

γ干扰素(IFN-γ)释放试验(interferon gamma release assay，IGRAs)通过检测外周血中结核菌抗原特异性IFN-γ的T细胞斑点试验(T-Spot．TB)，已用于临床对结核分枝杆菌感染的诊断。据报道，其是快速敏感的方法，在诊断结核性疾病中有重要的参考价值［3］。在美国，疾病预防控制中心推荐可用IGRAs替代TST 检测［4］。基于此，本文用T-Spot．TB方法及TST方法对2013年1月—2013年12月入住我科的230例菌阴肺结核患者和我院体检中心200例体检者平行检测，并对其结果进行分析，探讨其诊断菌阴肺结核的临床价值。

1 对象和方法

1.1 临床资料 选取2013年1—12月入住河北省胸科医院结核一科的菌阴肺结核230例为结核组，其中男119例，女111例，年龄18～80(36．20±18.32)岁。随机选取同期河北省胸科医院体检中心体检者200例为对照组，其中男111例，女89例，年龄25 ～80(32．12 ±16．04)岁。两组性别、年龄比较差异无统计学意义(P＞0.05)，具有可比性。

1.2 诊断标准

1.2.1 结核组:诊断标准参照卫生部结核病临床诊疗指南，菌阴肺结核诊断符合:①典型的肺结核临床症状和胸部X线表现;②抗结核治疗有效;③临床可排除其他非结核性肺部疾病;④支气管肺泡灌洗液检出抗酸杆菌;⑤支气管或肺部组织病理证实结核病变;⑥结核菌素(PPD 5TU)试验强阳性;血清抗结核抗体阳性;⑦痰结核分枝杆菌聚合酶链反应(PCR)和探针检测呈阳性;⑧肺外组织病理证实结核病变。其中1～5项为主要指标。

1.2.2 对照组:均经影像学及临床表现除外活动性结核病变。两组均无合并糖尿病、HIV阴性、无风湿免疫系统疾病、无严重心、肝、肾功能不全，所有受试者均知情同意参与。

1.3 检测方法 所有研究对象均同时进行T-Spot．TB检测及TST检测，即留取IGRAs用血后立即行TST检测。

1.3.1 T-Spot．TB检测:采用英国Oxford Immunotec公司生产的T-Spot．TB试剂盒，基本步骤如下:于治疗前分别取枸橼酸钠抗凝静脉血5 ml立即进行检测(样本采集后2 h内送实验室，4 h内完成检测)。外周血分离得到血单个核细胞(PBMC)并制备成浓度为2．0×106/ml的细胞悬液。细胞培养液作为阴性对照，植物血凝素PHA作为阳性对照，结核菌特异性抗原ESAT-6和CFP-10作为刺激抗原。每孔加入含2．5×105个细胞的细胞悬液，将微孔板放在含5%二氧化碳的培养箱中培养18～20 h，第2天洗板后加入生物素标记的二抗，2～8℃反应1 h，洗板后加入显色底物液，室温静置7 min，去离子水终止反应。通过CTL酶联免疫斑点系统记录斑点数。结果判定标准:当空白对照孔内斑点数＜6时，任一试验孔斑点数减去空白孔斑点数≥6，结果即为阳性;若空白对照孔斑点数≥6，任一试验孔斑点数≥2倍空白孔斑点数结果即为阳性。

1.3.2 TST检测方法:对所有入选者皮内注射5 IU(1∶2000)的人型PPD试剂(北京祥瑞生物制品有限公司生产)，72 h后观察结果，有红肿硬结且硬结直径≥15 mm者或有水泡或破溃者判为PPD试验阳性，否则判为阴性［5］。

1.4 统计学方法 所有数据均利用SPSS 18．0软件进行分析，计数资料以率(%)表示，采用 χ2检验，α=0．05为检验水准。

2 结果

2.1 T-Spot．TB检测与TST检测结果 结核组TSpot．TB检测阳性213例(92.61%)，对照组37例(18.50%)，两组比较差异有统计学意义(χ2=200.79，P＜0.05)。结核组 TST检测阳性108例(46.96%)，对照组为63例(31.50%)，两组比较差异有统计学意义(χ2=10.67，P＜0.05)。结核组TSpot．TB 检测阳性率明显高于 TST(χ2=56．83，P ＜0.05)。

2.2 性别对检出阳性率的影响 结核组男性TSpot．TB 检测阳性109例(91．60%)，女性检测阳性104例(93．69%);男性 TST检测阳性 57例(47.90%)，女性检测阳性51例(45.95%)。两种检测方法在不同性别检测阳性率比较差异无统计学意义(P ＞0．05)。

3 讨论

结核病是目前全球主要的公共卫生问题之一，据统计，全球共有约1/3的人感染了结核分枝杆菌。尽管目前临床抗结核治疗方案愈来愈规范，但诊断肺结核的检测手段仍无明显进展。痰的结核分枝杆菌检查是确诊活动性肺结核的特异性方法，但由于检测痰菌阳性率较低，菌阴肺结核占据了活动性肺结核的60%［6］，因此如何快速早期诊断及时治疗菌阴肺结核，对我国结核病的防治工作非常重要。

TST检测用于检测结核分枝杆菌感染已近百年历史，至今仍作为辅助诊断肺结核的重要指标之一［7］。但由于TST所用的某些抗原成分与卡介苗及结核菌的某些抗原成分相同，而我国卡介苗接种率及结核感染率较高，TST检测对于肺结核的诊断特异度较低。因此临床上将判断结核感染的TST检测红肿硬块直径提高到15 mm，以增加TST检测的特异性，但检出率却大幅降低。本研究结果表明结核组TST阳性检出率为46．96%，对照组中阳性检出率为31．50%。提示TST仍可作为辅助诊断菌阴肺结核的方法。但有研究表明，TST不适宜HIV感染者、幼年儿童等结核感染高危人群［8］。

IGRAs也是通过检测机体的细胞免疫功能判断是否感染结核分枝杆菌的方法。有研究表明，该技术已经成为一种新的判断结核分枝杆菌感染的快速辅助方法［9］。人体初次感染结核分枝菌后T淋巴细胞转化为记忆T淋巴细胞，当人体再次感染结核分枝杆菌时会迅速产生效应T淋巴细胞，产生多种细胞因子发挥免疫学效应。而IFN-γ是机体在免疫应答中最重要的细胞因子。IGRAs是利用结核特异抗原:早期分泌抗原靶6 kD(early secretory antigenic target 6000)ESAT-6、培养滤液蛋白10 kD(culture filtrate protein 10 000)CFP-10，通过ELISPOT检测受试者体内结核效应T淋巴细胞来判断受试者是否感染结核的新方法［10］。有研究结果表明，T-Spot．TB检测的综合敏感性为90%，即使在免疫力低下的人群中仍有较高的阳性率［11-12］。本研究结果表明在菌阴肺结核的诊断方面，T-Spot．TB检测阳性率较TST 高，与国内报道相符［13］，此为 T-Spot．TB检测的优势之一。

由于T-Spot．TB检测是以结核分枝杆菌的特异性抗原ESAT-6和CFP-10为抗原，这些抗原的蛋白编码位于结核分枝杆菌的一个基因片段RD-1，该基因片段不存在非结核分枝杆菌及牛分枝杆菌(包含卡介苗)中［14］。而PPD是含200种蛋白的混合物，其中很多是非结核分枝杆菌及卡介菌的共同抗原成分。由于结核分枝杆菌自身生长特点以及卡介苗接种在我国的广泛使用，TST对结核病诊断特异性不高。而T-Spot．TB检测可有效避免假阳性结果及筛查结核分枝杆菌感染［15］。另外，IGRA试验设置了阳性与阴性对照，可除外患者基础免疫状态及污染所致的结果不准确［16］，而且结核分枝杆菌IGRAs TSpot．TB检测作为一种体外特异性T细胞免疫应答检测技术与TST检测相比无需回访且结果判读更为客观。

本研究提示，IGRAs T-Spot．TB检测较 TST在菌阴肺结核中检出阳性率更高。但由于IGRAs的检测成本较高，且对实验室及标本采集要求较高，致使目前尚无法在基层医院广泛推广使用;此外，由于临床所获研究样本数量有限，IGRAs对菌阴肺结核诊断价值尚需进一步扩大样本量研究。

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