长链非编码RNA ANRIL的研究进展

江 澈，王伟民

(广州军区广州总医院 脑病中心，广东 广州510000)

长链非编码RNA(long non-coding RNAs，lncRNAs)是多细胞动物基因组的一个重要特征，包括长200～1 000 000bp 由DNA 转录而来但不编码蛋白的RNA。高通量转录组分析发现人类基因组中存在大量lncRNA，广泛参与机体的发育、分化、代谢等生理病理过程。ANRIL(antisense non coding RNA in the INK4 locus)是人Chr9p21 上CDKN2A/B 基因丛转录的长链非编码RNA，主要定位于细胞核。该基因区域与人类的一些疾病相关，既往的研究提示ANRIL 在介导Chr9p21位点的功能中发挥重要作用。

1 人类ANRIL的序列和进化特征

在对黑色素细胞瘤-神经系统肿瘤家族的遗传研究中，人们首次发现在人类全血白细胞和类淋巴母细胞系内存在一段位于INK4位点的反义非编码RNA，并将其命名为ANRIL(GenBank accession No.DQ485453)[1]。ANRIL 也 被 称 为CDKN2BAS 等。ANRIL 起源于胎盘哺乳动物，在哺乳动物进化过程中获得了额外的外显子，随后在啮齿类动物的进化中丢失了一部分，最终在猿类中完全形成，并变得高度保守[2]。编码ANRIL 基因的序列位于Chr9p21.3位点，其长度为126.3 kb。该基因可在与CDKN2A/B 基因丛相反的方向上选择性转录20个外显子，mRNA 全长3 834 bp[3]。很多外显子仅包含LINE、SINE 和Alu 重复元件。ANRIL的内含子1 包含p15/CDKN2B的外显子1 和2，其5'末端的外显子1位于p14/ARF 基因转录起始位点上游～300 bp 处。ANRIL 由RNA 聚合酶II 转录，可被剪接形成至少20种线性转录子或环形转录子，这些剪接变异子具有组织特异性[3-4]。在小鼠体内存在一段70 kb的基因序列，与人Chr9p21 上58 kb的冠心病危险区域同源[5]，其缺失导致CDKN2A/B表达的严重下调。这段70 kb的序列包含一段反义非编码RNA，但与人ANRIL 无同源性。

2 ANRIL的表达和调控

2.1 调控ANRIL表达的上游通路

一些9p21 上的SNPs 破坏了STAT1 等转录因子结合位点[6-7]，提示该位点的表达受到多种信号通路调控。该位点的SNPs 同时也能改变ANRIL的结构和基因表达[4，8-12]，并影响ANRIL 对多种疾病的易感性。ANRIL的调控具有细胞型特异性。促炎因子INF-γ 激活转录因子STAT1，诱导内皮细胞ANRIL的表达，但抑制类淋巴母细胞ANRIL的表达[7]。在ANRIL 和ARF的基因间区域的CpG 岛存在CCCTC 结合因子(CTCF)结合位点，CTCF 结合后保护DNA 不被甲基化，维持CDKN2A/B位点的稳定[13]。DNA 损伤刺激中，转录因子E2F1 能以ATM依赖的方式上调ANRIL的表达，参与细胞DNA 修复[14]。此外，ANRIL 也受到microRNA的调控[15]。

2.2 ANIRL的下游通路

ANRIL的外显子与其他功能性非编码RNAs 一样表达水平较低。较早发现的线性转录子有长链的NR_003529 以及短链的DQ485454 和EU741058。二代测序的研究结果表明ANRIL 不同外显子的含量存在差异[4]。ANRIL的功能不依赖于完整的转录子，存在的“茎环”等特殊结构能被多梳(Polycomb)蛋白识别并结合，包含这些结构的转录子即能成为独立的调控分子[16]。ANRIL的中央外显子(4至12号外显子)[4]形成环形同工型，其表达与心血管疾病危险等位基因相关。

多梳蛋白是一组参与转录基因抑制的蛋白，具有多梳抑制性复合物1 和2(PRC1 和PRC2)两种多蛋白复合物形式。PRC2 通过催化K27H3的甲基化参与基因沉默的启动，PRC1 通过单泛素化组蛋白H2A 参与靶基因沉默的维持。这些机制在细胞分化、细胞身份维持和肿瘤发生中发挥重要作用。ANRIL 能特异结合CBX7(PRC1 亚基)和SUZ12(PRC2 亚基)并调控CDKN2A/B位点的组蛋白修饰，启动并维持CDKN2A/B位点的沉默[17]。Dicer是RNA干扰机制的关键组分，负责siRNA 和miRNA的产生。ANRIL 也能以Dicer 蛋白依赖途径[18]沉默CDKN2B。ANRIL 也有除CDKN2A/B 外的其他作用靶点，参与细胞增殖、凋亡、衰老、细胞外基质和炎性应答等[6]。

3 ANRIL的功能以及在疾病中的表达

3.1 ANRIL 在肿瘤中的作用

ANRIL 与CDKN2A/B 基因座抑制相关。CDKN2A/B 基因座位于人类9号染色体p21 上，这段区域包括3个重要的肿瘤抑制基因:CDKN2A、CDKN2B和MTAP。其中CDKN2A 通过选择性阅读框编码2个不同的蛋白，P16和ARF。该区域在30%～40%的人类肿瘤中发生改变。全基因组关联研究(GWAS)表明ANRIL是神经胶质瘤、白血病、黑色素细胞瘤、基底细胞癌、鼻咽癌和乳腺癌等肿瘤的危险位点[17]。此外，ANRIL 还与前列腺癌、胃癌、胰腺癌和卵巢癌等肿瘤相关[15]。CDKN2A/B位点在年轻的健康细胞中被沉默，衰老和致癌因素能刺激其表达。该位点升高的表达与一些老化组织的再生潜能损害有关。CDKN2A/B 在人类肿瘤中被广泛沉默，提示其在抑制肿瘤发生中起关键作用。ANRIL 通过直接结合CDKN2B 转录子并募集PRC来抑制CDKN2A/B 基因座上的基因。在体内和体外实验条件，ANRIL的缺失或沉默与增殖降低相关[11]。降低的增殖可能是提前衰老的结果，这是一个重要的预防肿瘤发生的机制。最近的研究表明，ANRIL的表达在非小细胞肺癌组织中上调，并与肿瘤-淋巴结转移阶段和肿瘤大小显著相关[19]。与这些研究相反，在多发性神经纤维瘤患者，9p21.3位点的rs2151280-T 等位基因与ANRIL的表达降低和丛状纤维神经瘤数量增多相关[20]。此外，黑色素细胞瘤相关变异子rs1011970-T 也与ANRIL表达的降低相关[9]。由于ANRIL的多种外显子具有组织特异性，而既往研究针对的是不同的外显子区域，使得对相关性的解释较复杂。

3.2 ANRIL 在心血管疾病中的作用

ANRIL是9p21位点内引起动脉粥样硬化性血管疾病的首要候选基因，虽然其起促进或抑制的作用尚存争议[9-10]。GWAS 研究发现ANRIL 基因是冠心病和腹主动脉瘤等动脉粥样硬化性疾病的遗传易感位点[21]。后续研究证实了ANRIL 与这些疾病的联系[8]，9p21区域内与缺血性脑卒中和冠心病相关的SNPs位于ANRIL 基因[10]。一个大样本研究分析了4个9p21区域的心血管疾病相关SNPs，发现冠心病危险单倍型引起某些ANRIL 剪接子(EU741058 和NR_003529)表达升高，后者与动脉粥样硬化的程度一致[12]。亚洲印度人群的研究表明，9p21.3 冠心病危险间隔的5个遗传变异位点的CGGGG 单倍型具有较高的发病风险，而GAAAA 单倍型则具有预防冠心病的作用。其中，rs2383206 与冠心病具有最强的关联，GG 基因型与ANRIL 转录子EU741058表达升高和p16表达降低相关[22]。一项对中国汉族人群脑卒中的随机对照研究发现，rs10757278 和rs10757274的GG 基因型与脑卒中(包括动脉粥样硬化血栓形成、腔隙性梗死和脑出血，排除了栓塞性卒中和蛛网膜下腔出血)风险升高和复发有关。Rs10757278的GG 基因型与AA 基因型相比，MTAP、ANRIL 短转录子DQ485454 和EU741058 在粥样硬化斑块内的表达显著降低，而p16INK4a 和ANRIL 长转录子NR_003529表达升高[23]。此外，几个小样本的研究发现冠心病和脑卒中的危险等位基因与ANRIL 降低的表达相关[8-9，11]。另有研究表明，ANRIL的5个相关SNPs与冠状动脉微血管功能有关[24]。ANRIL 可能参与动脉粥样硬化中的血栓形成、血管壁重建和修复和斑块稳定机制。ANRIL 可能通过调控CARD8 进而增加缺血性脑卒中的风险[6]。Alu元件是灵长类基因组特有的含量丰富的短散在重复序列，ANRIL 能通过转录子上的Alu 模体标记靶基因的启动子从而反式调控，引发动脉粥样硬化的相关机制[3]。

动物研究方面，人们建立了染色体4qC4/5位点70 ku 缺失的重组小鼠系，该区域与人9p21.3 上的58 ku 非编码间隔同源，包含ANRIL的3'末端(Δ58:外显子13-19)[5]。Chr4Δ70 kb/Δ70 kb小鼠的原代主动脉SMCs表现出过度的增殖和减弱的老化，该过程能促进冠心病的发生。小鼠体内的CDKN2A 有促进动脉粥样硬化的作用，而MTAP 具有保护作用。MTAP-ANRIL 融合转录子在动脉粥样硬化中的作用需要进一步研究。

此外，ANRIL 也与非粥样硬化性血管病如颅内动脉瘤相关[25]。ANRL的这些与心血管疾病的关联是独立于大多数传统危险因素的，可能是一个新的病因[10]。

3.3 ANRIL 在其他疾病中的作用

GWAS表明ANRIL是2型糖尿病的遗传易感位点，9p21区域糖尿病相关危险变异子(rs10811661-T 和rs2383208-A)与ANRIL表达的下调相关[9]。此外，一些研究表明ANRIL的表达与牙周炎、骨髓纤维化、阿尔茨海默病、青光眼和子宫内膜异位等多种疾病相关。

4 问题和展望

非编码RNA 能通过多种机制介导基因表达调控。关于短链非编RNAs 如microRNAs的研究已有大量报道。近年来，长链非编码RNAs 逐渐被发现是基因表达的重要调控子。其中，Chr9p21.3位点的长链非编码RNA ANRIL 在介导多种疾病中发挥重要作用。

虽然ANRIL 参与多种组织特异性表观调控机制，但它的很多功能无法用现有的机制解释。存在几个主要问题:第一，ANRIL 参与众多病因不相关的疾病的发生和发展，也参与移动/黏附、增殖和死亡/凋亡等细胞过程，ANRI 通过怎样的机制参与这些疾病，这些疾病又存在何种潜在关联有待进一步研究;第二，ANRIL 具有多种线性和环形同工型，发挥不同的生理作用，它们的作用方式、相互之间的联系不清楚，既往的研究通过检测少数几个外显子测定某种同工型的含量，可能混杂了其他同工型，今后的研究需更加特异、全面地测定并区分所有同工型;第三，ANRIL 拥有大量下游靶点，不仅调控临近的CDKN2A/B 基因，也有独立于CDKN2A/B的通路机制，其他通路需要进一步的研究来揭示。此外，由于ANRIL 在啮齿类动物中不存在同源性，只能用人体细胞进行离体实验，为研究带来不便。

ANRIL是在不同水平和细胞类型中介导人类疾病的关键调控分子，目前它已经成为一些肿瘤和动脉粥样硬化的生物标记，其水平的高低反应疾病的严重程度。随着研究的进展，ANRIL的作用机制将被进一步揭示，未来有望成为治疗人类疾病的新靶点。

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