恶性肿瘤外泌体蛋白质组学研究进展

肖忠华，苗加伟

(重庆三峡医药高等专科学校 医学技术系，重庆 万州404120)

外泌体是多种活细胞主动向胞外分泌的囊泡样小体，直径通常在40～100 nm，密度在1.10～1.18 g/mL，包含蛋白质、RNA 和脂类等多种成分[1]。蛋白质组学是在大规模水平上研究蛋白质的表达水平、翻译后修饰、蛋白与蛋白相互作用等蛋白质组的特征，来获得蛋白质水平上的关于疾病发生，细胞代谢等过程的整体而全面的认识的一门科学。近年来，以肿瘤来源或与肿瘤相关的外泌体为研究对象，蛋白质组学技术平台为研究工具，在阐明外泌体通过调节免疫、促进血管新生和转移等调控肿瘤发生发展的机制和发现肿瘤生物标志物方面取得了一些进步，为肿瘤临床诊疗带来了新的契机[2-3]。本文对来源于消化系统、泌尿生殖系统和其他系统的恶性肿瘤或与这些肿瘤相关的外泌体蛋白质组学研究进行归纳总结。

1 外泌体蛋白质组学在消化系统肿瘤中的应用

1.1 胰腺导管癌

胰腺导管癌是最具侵袭性的恶性肿瘤之一。网蛋白是胰腺癌潜在的生物标志物并在胰腺导管癌标本中过表达，网蛋白(plectin)基因具有11个选择性第一外显子，其中8个可编码，因而至少有8个变体，网蛋白相对分子质量大于500 ku，广泛表达于皮肤、肌肉和脑等各种组织中，但通常只定位于细胞质[4-5]。胰腺导管癌细胞外泌体功能蛋白质组学试验表明:胰腺导管癌细胞膜表面经外泌体分泌途径过表达网蛋白，网蛋白表达依赖于整合素β4，网蛋白显著影响外泌体蛋白质组，并在细胞模型和大鼠移植瘤动物模型试验中证实网蛋白1a 和1f 在抑制胰腺导管癌细胞增殖、侵袭和转移中具有重要作用，提示网蛋白可能也是胰腺导管癌生物标志物[6]。这一实验表明:恶性肿瘤细胞可能通过外泌体分泌抑制恶性肿瘤发生发展的蛋白质而存活，深入研究外泌体中高表达或低表达的蛋白质可能发现恶性肿瘤发生发展的分子机制，这些高或低表达的蛋白有可能成为恶性肿瘤诊断的生物标志物。

1.2 结肠直肠癌

结直肠癌细胞系外泌体蛋白质组学研究较多[7-12]。早期结直肠癌、隐形染色体家族性腺瘤样息肉和大多数散发性结直肠癌中均发现肿瘤抑制基因APC(adenomatous polyposis coli)突变。APC 基因编码的APC蛋白参与多种细胞生理活动，APC 基因突变时，APC 基因编码的蛋白不能与β-catenin/axin/CK1/GSK3β 形成降解复合物，β-catenin 聚集进入胞核，与转录因子家族成员TCF/LEF 相互作用，促进Wnt信号通路特定基因的表达，可能导致结肠直肠癌发生发展。在转染APC 基因质粒的SW480细胞和SW480 细胞分泌的外泌体蛋白质组比较研究中，免疫杂交、半定量PCR 和免疫金电镜证实阻黑体4(dickkopf-related protein 4，DKK4)高表达于转染APC 质粒的SW480 细胞外泌体中，甲基化特异PCR 分析表明:转染APC 质粒的SW480 细胞中DKK4 基因启动子甲基化水平降低，荧光定量PCR分析表明:DNMT-3a(DNA甲基化转移酶3a)下调，提示结肠直肠上皮细胞可能通过下调DKK4 基因启动子甲基化，上调DKK4 转录和表达，通过外泌体分泌DKK4 诱导APC 基因突变、调节Wnt信号通路，促使结直肠癌发生发展[7]。30%～40%结直肠癌细胞会发生K-RAS 突变，比较研究DLD-1 细胞的KRAS 野生型DKs-8 细胞和K-RAS突变型细胞DKO-1 细胞分泌的外泌体蛋白质组表明:DKO-1 外泌体孵育的DKs-8 细胞不仅明显增殖，而且侵袭能力得以增强[8-9]。以上实验表明，结直肠癌细胞外泌体在维持结直肠癌细胞存活、增殖和侵袭微环境中发挥着重要作用。

2 外泌体蛋白质组学在泌尿生殖系统肿瘤中的应用

2.1 肾细胞癌

肾细胞癌约占人恶性肿瘤3%，其发生率逐年上升。在一项比较研究来源于9例肾细胞癌患者混合尿外泌体和23例健康对照组的混合尿外泌体的试验中发现，患者混合尿外泌体中基质金属蛋白酶9(matrix metalloproteinase 9，MMP9)、血浆铜蓝蛋白(ceruloplasmin，CP)、足萼蛋白(podocalyxin，PODXL)、DKK4、碳酸酐酶Ⅸ(carbonic Anhydrase IX，CAIX)高表达，而水通道蛋白1(aquaporin-1，AQP-1)、基质金属蛋白酶诱导因子(extracellular Matrix Metalloproteinase Inducer，EMMPRIN)、中性溶酶(neprilysin，CD10)、二肽酶1(dipeptidase 1)、多配体聚糖结合蛋白1(syntenin-1)低表达，以10个蛋白西方杂交试验结果制作的ROC 曲线AUC值在0.73～1 之间，提示同时应用10个蛋白组成的外泌体蛋白质组具有潜在的早期诊断肾细胞癌的临床价值[13]，这表明恶性肿瘤外泌体蛋白质组学研究可能发现恶性肿瘤潜在的早期诊断生物标志物。

2.2 膀胱癌

膀胱癌是泌尿系统仅次于前列腺癌的恶性肿瘤发生率。无转移能力的膀胱癌T24 细胞、具大鼠肺组织和肝组织转移能力的T24 等位基因SLT4 和FL3细胞株的外泌体蛋白质组比较研究表明:波形蛋白、肝癌衍生生长因子和酪蛋白激酶Ⅱα、膜朕蛋白A2 等与上皮间叶细胞移行相关蛋白质只存在于两株具转移能力细胞株外泌体中[14]，揭示恶性肿瘤细胞来源的外泌体发挥着维系肿瘤细胞侵袭能力微环境的功能。

2.3 前列腺癌

前列腺癌是男性发病率高的恶性肿瘤。雄激素受体阳性(AR+ve)细胞株VCaP、C4-2和LNCaP，RWPE-1 正常前列腺上皮细胞株，雄激素受体阴性(AR-ve)DU145细胞株等5种细胞的外泌体蛋白质组比较研究结果显示:四甲基罗丹明染色的具侵袭性前列腺癌DU145细胞外泌体分别与PC-3、VCap、LNCaP、C4-2和RWPE-1 细胞温育过夜，共聚焦显微镜下观察发现，DU145 外泌体不断靠近上述细胞的细胞膜并进入细胞质，有趣的是细胞核周围外泌体浓度最大的是RWPE-1 细胞株[15]，表明恶性肿瘤细胞外泌体可直接参与肿瘤细胞侵袭，促进肿瘤发展。

2.4 卵巢癌

卵巢癌是致死率最高的妇产科肿瘤。外泌体蛋白质组学试验表明[16-17]:卵巢癌细胞外泌体富含与卵巢癌肿瘤发生发展相关的整合素通路、EGF 受体通路、Wnt信号通路、PI3 激酶通路、FGF 受体信号、Ras、P53 和血管新生通路等蛋白，包括大量磷酸化、乙酰化蛋白，而这些磷酸化、乙酰化蛋白在调节细胞与基质之间的通讯方面起着重要作用。深入研究这些磷酸化蛋白、乙酰化蛋白等生物大分子之间的相互作用和其在信号传导等通路中发挥的功能则有可能阐明恶性肿瘤发生、发展的重要分子机制。

3 外泌体蛋白质组学在其他肿瘤中的应用

外泌体蛋白质组学研究也应用于乳腺癌细胞、黑色素瘤细胞、人脑髓母细胞瘤细胞。在乳腺癌MCF-7 和MDA-MB231 细胞外泌体中的蛋白质组比较研究中发现，MDA-231 外泌体包含更高水平的基质金属酶蛋白质，这可能与MDA-231 细胞的转移性更强相关[18]。人表皮黑素细胞HEMa-LP、NHEM-c和人恶性黑色素瘤细胞A375、SK-MEL-28 外泌体蛋白质组研究显示，人表皮黑素细胞HEMa-LP、NHEM-c 分别与人恶性黑色素瘤细胞A375 和SKMEL-28的外泌体孵育后，共聚焦显微镜显示A375、SK-MEL-28 外泌体进入到HEMa-LP、NHEM-c 细胞质中，侵袭实验表明摄入A375、SK-MEL-28 外泌体的HEMa-LP、NHEM-c 增强了侵袭能力[19]。无侵袭能力人脑髓母细胞瘤细胞UW228 和DAOY细胞分别与来自具侵袭能力的人脑髓母细胞瘤D283MED细胞的外泌体孵育后，UW228 和DAOY细胞均显著增强了增殖和迁移能力，迁移能力与外泌体浓度呈正相关[20]。这些研究进一步证实恶性肿瘤细胞来源的外泌体在维系肿瘤细胞增殖、侵袭和迁移方面发挥着重要作用。

4 结语

从来源于恶性肿瘤的细胞培养液或与恶性肿瘤相关的体液中分离的外泌体蛋白质组学研究表明，肿瘤细胞来源或与之相关的外泌体在形成和维持肿瘤细胞存活、增殖和转移侵袭的微环境，诱导肿瘤细胞增殖等方面发挥着重要作用[21]。然而，恶性肿瘤外泌体蛋白质组学研究还处于起步阶段，尚不够深入，如外泌体中蛋白质的相互作用报道鲜见。可以预见，随着外泌体蛋白质组学研究的不断深入，人们对外泌体，乃至整个细胞囊泡系统在肿瘤发生发展过程中的机制将得以进一步阐释，外泌体临床应用将具有更良好的前景。

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