人体肝癌细胞系SMMC-7721非显带技术下的核型分析

范 宁，高 磊，汪 艳，米亚静，景晓红

(1.西安医学院临床医学院，陕西 西安710021；2.西安医学院基础医学部细胞生物学与遗传学教研室，陕西 西安710021)

人体肝癌细胞系SMMC-7721非显带技术下的核型分析

范 宁1，高 磊1，汪 艳1，米亚静2，景晓红2

(1.西安医学院临床医学院，陕西 西安710021；2.西安医学院基础医学部细胞生物学与遗传学教研室，陕西 西安710021)

目的应用非显带技术，分析人体肝癌细胞系SMMC-7721的染色体核型。方法体外培养SMMC-7721细胞，通过秋水仙素使细胞同步化，低渗、滴片、吉姆萨染色，进行非显带染色体核型分析。结果数目方面，SMMC-7721细胞系核型的众数为60～70条，峰值主要出现在E组，通过分析染色体数目在50～70个之间的较清晰的25个核型发现，E、F、G组染色体总数大多过半甚至超过60%；结构方面，分辨出双着丝粒染色体、含有3个着丝粒的染色体和环状染色体。结论上述染色体的数目异常与结构畸变，对认识肝细胞的转化、恶变以及临床的初步诊治提供了细胞遗传学基础。

SMMC-7721；非显带；核型分析；超二倍体

原发性肝癌是一种危害性较大的恶性肿瘤，过去对肝癌的研究，多采用由致癌剂诱发的肝癌动物模型，但这种动物的肝癌模型毕竟和人体肝癌的生物学特性存在着相当大的差异[1]。因此，我们通过体外培养人体肝癌细胞株SMMC-7721，利用非显带技术对其进行染色体核型分析，为认识肝癌细胞的遗传学特性提供实验数据。

1 资料与方法

1.1 细胞培养 SMMC-7721传代培养2～3 d，待细胞生长密度为70%～80%，加1µg/ml秋水仙素作用4～6 h。胰酶消化细胞，用1640培养基和10%胎牛血清终止消化，离心，弃去上清液，用磷酸盐缓冲液(PBS)清洗细胞1次，再离心，弃上清。

1.2 低渗处理 加入0.075 mol/L KCl低渗液至6ml，轻轻混匀，37℃水浴20min。

1.3 预固定 加入固定液(甲醛:冰醋酸=3:1)1ml，轻轻混匀。预固定2min，1500 r/min离心10min，弃去上清液，保留底部细胞。

1.4 固定 加入固定液至8ml，混匀固定30min，1500 r/min离心8min，弃去上清液。重复固定一次。

1.5 滴片 加至1ml固定液制成细胞悬液，悬空15～20cm滴1～2滴细胞悬液至冰水中取出的载玻片上，迅速过酒精灯火焰烤片3～5min。

1.6 染色 在标本上加数滴吉姆萨染液，染色20～30min，用水冲洗。

1.7 显微镜观察 在低倍镜下找到短小似棒状处于分裂中期细胞的染色体，转换油镜继续观察，选择染色体分散、没有重叠且团聚性较好的细胞，通过图像采集系统Motrc Images Advanced3.2镜下采图，拍照，计数，分析肿瘤细胞染色体数目与结构。

2 结果

本次标本共采集了153个细胞进行染色体分析，肝癌细胞系SMMC-7721在传代培养过程中仍保持其上皮细胞的形态。

2.1 数目方面 在153个核型中：①SMMC-7721细胞系染色体数目的众数出现在60～70条(图1)。②拥有65条染色体的细胞21个，68条染色体的细胞9个。我们进一步分析了染色体数目在50～70个之间的较清晰的25个核型发现。③C组染色体的数目在A、B、C、D组中最多。④各细胞中数目异常的峰值多出现在E组(表1)。⑤E、F、G组染色体总数40%～50%4个，50%～60%15个，60～70%6个，大多达到50%甚至超过60%。

图1 SMMC-7721非显带核型中染色体的数目分布

表125个核型中E、F、G组染色体数目统计表

图2 SMMC-7721非显带核型中染色体的结构异常

2.2 结构方面 在非显带技术下，标本中可见1～4个数目不等的双着丝粒染色体(图2A)、三着丝粒染色体(图2B)以及环状染色体(图2C)。其中，具有1个、2个、3个、4个双着丝粒染色体异常的核型个数为9个、7个、3个、1个，具有三着丝粒染色体的核型个数为5个，具有环状染色体异常的核型个数为10个。

3 讨 论

关于SMMC-7721细胞系的染色体数目变化，分析结果较董荣春等[1]在染色体数目上有不同程度的增加，这可能是不同实验室获得同一个细胞株后，在离体培养和传代过程中细胞发生演变造成的，还发现有近90%(137/153)的标本其染色体属于超二倍体，可能与肝癌细胞在有丝分裂时染色体不分离或染色体缺失有关，而无丝分裂、核内不均等分裂也可能参与了数目畸变的形成[2]。而核型数为(65,68)的标本出现的频率较高，可能是在此状态下更有利于肝癌细胞的存活。关于为何在25个核型里C组染色体数目在A、B、C、D组中最多，已有文献报道，C组内的8号染色体存有癌基因，11号染色体的长臂是断裂重接位点，已知该位点既是频发断裂点又是脆性位点和癌基因位点，因此，8号与11号染色体均以较高的频率参与肿瘤染色体的重排[3]。关于为何在25个核型中E组出现峰值以及E、F、G组染色体总数大多过半甚至超过60%，我们分析，前者可能是因为E组的17号染色体长臂含有脆性位点17q11，而该位点与癌基因位点eib-A-1相近，参与肝癌细胞的转化和癌变[4]；后者可能是由于A、B、C大染色体组的染色体缺失、断裂从而形成了近似E、F、G组大小的染色体，而这些染色体中同样含有较多的癌基因和脆性位点，共同导致了肝细胞的恶变[5]。

从结构上看，出现了双着丝粒染色体，分析是由于非同源染色体的缺失断裂之后，含有着丝粒的染色体两两组合形成的。至于出现含有三个着丝粒的染色体，一方面可能是因为在非显带技术下将扭曲或粘连的染色体误认为含有三个着丝粒的染色体，另一方面也可能是因为两条染色体在形成过程中各自末端缺失，第三条染色体两个末端均有缺失，继而这三条染色体的四个粘性末端连在一起。由于含有三个着丝粒染色体的细胞属于不稳定性染色体畸变，在其传代以及生长时，将会因为基因重复、缺失以及形成新的结构畸变而造成对细胞个体致命的损伤。环状染色体的出现可能是因为一条染色体的长臂和短臂均出现缺失形成粘性末端[2]，而后相连形成环状，或者染色体在复制分裂过程中两条姐妹染色单体同侧缺失形成粘性末端后自身相连成为部分环状。然而，上述数目异常和结构异常发生的确切原因，有待于进一步的染色体显带或FISH等技术确定。

通过上述研究，分析肝癌细胞转化、恶变的可能过程是：大染色体含有较多的脆性位点和癌基因[1]，进而频发断裂形成粘性末端并暴露癌基因，然后发生重组，形成等臂、双着丝粒染色体[2]，促使原癌基因激活，最终加速细胞恶变[6-8]。上述关于肿瘤细胞染色体的核型分析将对肝癌细胞的转化，癌变提供一定的细胞遗传学基础。

[1]董荣春,周荣华,吕发度,等.SMMC-7721人体肝癌细胞株的建立及其生物学特性的初步观察[J].第二军医大学学报,1980,1(1):5-9.

[2]左 伋.人类染色体//何俊林.医学遗传学[M].6版.北京:人民卫生出版社,2013:104-116.

[3]周后龙,巩 丽,张 伟,等.原发性肝癌8号和16号染色体杂合子丢失的研究[J].现代肿瘤医学,2012,20(6):1134-1137.

[4]李福才,孙开来,李呈姜,等.人体肝癌细胞系SMMC-7721的高分辨染色体研究[J].中国医科大学学报,1988,17(4):259-263.

[5]曹 岩,刘 红,刘永红.肝癌患者淋巴细胞染色体脆性部位与原癌基因的相关性[J].吉林大学学报(医学版),2006,32(4):662-664.

[6]曹来蓉,张超英,纪 静.脆性部位与原癌基因在乙型肝炎患者中的相关性[J].青岛大学医学院学报,2000,36(2):101-103.

[7]王 娟,倪 虹,陈 力,等.肝癌细胞的染色体变异[J].国外医学:遗传学分册,2004,27(2):90-92.

[8]李生平,王辉云,张昌卿,等.原发性肝癌全基因组杂合性缺失的研究[J].中华医学杂志,2000,80(8):577-581.

Karyotype analysis of human hepatoma cell line SMMC-7721 using non-banding techniques.

FAN Ning1,GAO Lei1,WANG Yan1,MI Ya-jing2,JING Xiao-hong2.1.Department of Clinic Medicine,Xi'an Medical University,Xi'an710021,Shaanxi,CHINA;2.Department of Basic Medicine,Xi'an Medical University,Xi'an710021,Shaanxi,CHINA

ObjectiveTo analyze karyotype of human hepatoma cell lines SMMC-7721 using non-banding technique.MethodsSMMC-7721 cells were culturedin vitro,followed by cell synchronization with colchicine,hypotonic treatment and Giemsa staining,and then non-banding karyotype was analyzed.ResultsThe majority number of karyotypes of SMMC-7721 cell lines was60 to70.Peaks occurred mainly in the E group,and the majority of E,F,G groups were more than half of the total number of chromosomes or even more than60%(25/128).For the structure of chromosomes,dicentric chromosome,chromosome sharing three centromeres and ring chromosome could be found in a few cells.ConclusionThe analysis of the abnormal chromosome will help us to deeply understand transformation and deterioration of liver cells,which provides the genetic basis for preliminary clinical diagnosis and treatment.

SMMC-7721;Non-banding;Karyotype analysis;Hyperdiploid

R735.7

A

1003—6350（2015）20—2967—03

2015-05-13)

10.3969/j.issn.1003-6350.2015.20.1081

西安医学院校级重点学科细胞生物学、西安医学院校级精品资源共享课程(编号：XYZL2014-3)；陕西省大学生创新创业计划(编号：201211840010、201211840011)；陕西省优势学科建设经费资助

景晓红。E-mail：Jingxh666@163.com