游离棉酚代谢产物gossypolone 的半合成法制备及质谱表征

姚军，武钰，张煌涛，李东雨，鹿毅，李莉

(1.新疆产品质量监督检验研究院，新疆 乌鲁木齐 830004;2.新疆医科大学 药学院，新疆 乌鲁木齐 830054)

棉花是我国重要的经济作物，我国是世界最大的棉花生产国，其面积、单产和总产量均居世界首位［1-2］，新疆是我国重要的棉花主产区，2014 年棉花产量为367. 7 万t，约占全国棉花总产量的59.7%［3］。棉酚是一种从陆地棉根、茎、叶、种子中提取得到的多元酚类物质，又称棉籽醇，集中在棉籽仁的球状色腺体中，是一种姜黄色无气味的多酚色素，在棉籽中的含量为0.15% ～1.8%，占棉仁质量的1.5% ～2.7%［4］。棉酚的存在形式有2 种，为游离棉酚和结合棉酚。其中游离棉酚对人体的大部分脏器都有损害，对生殖系统和对肾脏的危害最大［5］，引起男性精子数和睾丸体积减少，导致女性闭经、子宫萎缩、子宫肌瘤和功能性子宫出血［6］。

棉酚化学性质非常不稳定，在放置过程中极易发生降解，当棉酚进入动物体内，大部分棉酚会排出体外，部分会蓄积在肝、肾等器官中。另外，棉酚会在体内发生代谢，产物主要为其氧化产物gossypolone(6，6＇，7，7＇-四羟基-5，5＇-二异丙基-3，3＇-二甲基-［2，2＇］-联萘-1，1＇，4，4＇-四酮基-［8，8］-二甲醛，分子式C30H26)，具有较强的毒性。目前对该氧化产物研究较少，无法购买到对照品。

本实验以游离棉酚为反应物，利用FeCl3氧化制备gossypolone，考察了反应条件，利用质谱方法进行表征，并进行了纯度测定。

1 实验部分

1.1 试剂与仪器

乙腈、甲酸均为色谱纯;六水合三氯化铁、丙酮、乙醚、硫酸、冰乙酸均为优级纯;棉酚(纯度≥98%)。

TSQ Quantum 三重四极杆液质联用仪;Xevo G2-S QTOF MS 飞行时间液相色谱质谱/质谱联用仪;Agilent1220 高效液相色谱仪;RE-5203 旋转蒸发仪;BS124S 电子天平;KQ5200 超声波清洗器;Milli-Q Gradient 纯水器;HH-4 数显恒温水浴锅;DHG-9123 热风循环烘箱。

1.2 gossypolone 的制备

精密称取0.200 2 g 棉酚置于100 mL 圆底烧瓶中，加入冰乙酸、丙酮及10%FeCl3·6H2O 水溶液各20，10，15 mL，边加边搅拌，混合均匀后，将圆底烧瓶置于恒温水浴锅上回流加热，冷却，加入25 mL 蒸馏水。将黑褐色混合液转移至250 mL 分液漏斗中，加入乙醚和20%硫酸溶液各60 mL，摇匀，使析出的氧化产物溶解在乙醚层中，静置，分层，弃去下层水溶液，将上层溶液转移至50 mL 圆底烧瓶中，采用旋转蒸发仪挥去乙醚，将黑褐色物质置于蒸发皿上，干燥，得黑褐色粉末，－20 ℃冰箱中冷冻保存。

1.3 gossypolone 表征

1.3.1 准确分子量的测定 精密称取10 mg 棉酚氧化产物置于100 mL 容量瓶中，用含10%冰乙酸的乙腈溶液溶解，并定容至刻度，摇匀，得浓度为100 μg/mL 的棉酚氧化产物储备液。精密吸取储备液1 mL 置于10 mL 棕色容量瓶中，用含10%冰乙酸的乙腈溶液定容至刻度，摇匀，得浓度为10 μg/mL 的棉酚氧化产物供试品溶液。

ESI-QTOF/MS 条件:在负离子模式下进行检测，毛细管电压3.0 kV，离子源温度100 ℃，脱溶剂气温度280 ℃，脱溶剂气流量800 L/h，锥孔气流量1 L/h，锥孔电压40 V，流动相为乙腈∶0.5%甲酸=75 ∶25，流速0.2 mL/min。脱溶剂气、雾化气和锥孔气为氮气，碰撞气为氩气。通过IntelliStart(MassLynx 4.1 的一个内嵌软件)用0.5 mmol 的甲酸钠校正质量轴至误差小于1 ×10－6。m/z 测定范围为100 ～1 200，供试品溶液经0.22 nm 微孔滤膜过滤，进样。

1.3.2 特征碎片离子检测 采用TSQ Quantum 三重四极杆液质联用仪进行特征碎片离子的检测，色谱柱 YMC-Pack ODS-AM (150 mm × 3. 0 mm，3 μm)，流动相为乙腈∶1% 甲酸= 90 ∶10，流速0.5 mL/min，柱温25 ℃，选择性反应监测(SRM)，离子化方式为电喷雾离子化(ESI)，其他质谱条件待优化。

1.3.3 纯度测定 采用HPLC 测定，色谱柱YMCPack ODS-AM(150 mm ×3.0 mm，3 μm)，流动相为乙腈∶1% 甲酸=85 ∶15，流速0. 5 mL/min，柱温25 ℃，进样量10 μL，检测波长235 nm。

2 结果与讨论

2.1 制备工艺的优化

2.1.1 氧化剂FeCl3·6H2O 水溶液加入方式的选择 FeCl3·6H2O 水溶液在氧化过程中起关键作用，根据文献中的方法［8］，需在棉酚与冰乙酸、丙酮混合液一同加热的过程中加入FeCl3·6H2O 水溶液，由于棉酚的热不稳定性，需对此方法进行优化。

FeCl3·6H2O 水溶液加入棉酚与冰乙酸、丙酮混合液的方式有3 种:①先加入后加热;②先加热后加入;③先加入一半体积量，回流加热时再加入另一半体积量。结果表明，3 种方法都能制备得到氧化产物，产率分别为91.06%，83.62%，89.21%，纯度分别为95. 6%，88. 9%，93. 4%，即采用先加入FeCl3·6H2O 水溶液，后进行冷凝回流加热的方法为好。

2.1.2 回流加热温度的选择 对回流加热的温度进行考察。结果表明，80，90，100 ℃三个不同温度制备得到的氧化产物的纯度分别为82. 9%，94.6%，88. 4%，产 率 分 别 为83. 5%，90. 2%，92.3%。由于后续实验需对氧化产物进行鉴定和拆分，要求其具有较高的纯度，故选择回流加热温度为90 ℃。

2.2 准确分子量的测定

经飞行时间质谱仪检测，［M-H］－m/z 545.144 2的质谱图见图1。

图1 棉酚氧化产物gossypolone 样品QTOF MS 质谱图Fig.1 Mass spectrum by QTOF MS of gossypolone

由图1 可知，氧化产物M 的准确分子量为546.152 0;而 gossypolone 分 子 量 理 论 值 为546.151 8，说明反应产物与gossypolone 分子量吻合很好。

2.3 特征碎片离子

对氧化产物进行ESI 正、负离子的一级质谱全扫描，在正、负离子模式下均有特征离子峰，喷雾电压3 500 V，鞘气压力3 500 kPa，辅气压力1 750 kPa，毛细管温度350 ℃，反吹压力175 kPa，锥孔电压2 100 kPa。经过优化，得到3 个响应较高的氧化产物的碎片离子，m/z 分别为273. 1，244. 2，257.3，这3 个特征离子的产生均可由gossypolone 裂解产生，碎片离子质谱图及裂解途径见图2。

图2 碎片离子质谱图及裂解途径Fig.2 Fragment ion mass spectra and fragmentation pathways

2.4 gossypolone 纯度

gossypolone HPLC 分析，结果见图3。

图3 gossypolone 样品溶液HPLC 色谱图Fig.3 HPLC chromatogram of gossypolone sample solution

由图3 可知，gossypolone 的保留时间为4.250 min，用面积归一法计算得出gossypolone 的纯度为95.7%。

3 结论

(1)以棉酚为原料，采用半合成法制备棉酚氧化产物gossypolone 的适宜条件为:先加入FeCl3·6H2O 水溶液后进行冷凝回流加热，回流加热温度为90 ℃，产率90.2%。

(2)采用EIS-QTOF/MS 飞行时间质谱和LCMS/MS 对产物的结构进行验证，确定制得的化合物为gossypolone，纯度95.7%。

［1］ 喻树迅，王子胜. 中国棉花科技未来发展战略构想［J］.沈阳农业大学学报:社会科学版，2012，14(1):3-10.

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［3］ 新华社.2014 年我国棉花产量616.1 万t，同比减产2.2%［J］.福建农业科技，2014(12):11.

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［6］ Randel R D，Chase C C，Wyse S J.Effects of gossypol and cottonseed products on reproduction of mammals［J］.Journal of Animal Science，1992，70(5):1628-1638.

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