抗疏健骨颗粒醇提工艺优选研究

史传道 杜 星 郭东艳 王 露 曹 瑞

（陕西中医学院，陕西咸阳712046）

抗疏健骨颗粒由淫羊藿、杜仲、牛膝、白术、丹参等药味组成，具有补肾健脾、活血壮骨的功效，主要用于脾肾两虚、气血瘀阻导致的骨质疏松症。淫羊藿、杜仲为方中的主要药味，现代药理研究表明，两味药中的成分具有抗骨质疏松作用[1-4]。结合文献报道及预实验结果，本实验拟在单因素实验筛选的基础上，以淫羊藿苷、总黄酮含量及醇浸出物得率的加和作为综合评价指标，采用星点设计响应面分析法对乙醇回流提取工艺进行考察，为抗疏健骨颗粒剂的进一步研究提供参考依据。

1 实验材料

1.1 材料 淫羊藿 （批号：130401）、杜仲 （批号：130501），购于西安盛兴中药饮片有限责任公司；淫羊藿苷对照品 （供含量测定用，批号：110737-200415），出自中国食品药品检定研究院；乙腈、甲醇为色谱纯（Honeywell）；水为过滤后的娃哈哈纯净水。

1.2 仪器 安捷伦1260型高效液相色谱仪（G1311C型四元泵，G1329B型进样器，G4212B型二极管阵列检测器，ChemStation for LC 3D systems），UV-2550紫外可见分光光度计 （日本岛津），Sartorius MC电子天平 （十万分之一），METTLER TOLEDO（AL204）电子天平（万分之一），RE-52AA旋转蒸发器，SHB-Ⅲ型循环水式多用真空泵，D101型电热鼓风干燥箱，SAITEXIANGYI 530离心机。

2 方法与结果

2.1 淫羊藿苷含量测定

2.1.1 色谱条件 色谱柱：Thermo ODS C18（250mm×4.6mm，5μm）；流动相： 乙腈-水 （30∶70）； 流速：1.0mL/min；检测波长为 270nm；柱温：20℃。

2.1.2 对照品溶液的制备 精密称取淫羊藿苷对照品适量，加甲醇制成每1mL含0.1mg的溶液，即得。

2.1.3 供试品溶液的制备 精密移取各样品液1mL，置10mL量瓶中，加入70%乙醇稀释至刻度，摇匀，0.45μm微孔滤膜滤过，取续滤液，即得。

2.1.4 线性关系考察 分别精密吸取淫羊藿苷对照品溶液 （浓度 0.1mg/mL）1、2、4、6、8、10、12μL，按2.1.1项下色谱条件，测定峰面积。以峰面积A对淫羊藿苷含量C（μg）进行线性回归，计算回归方程为：y=730.19x+3.1022，相关系数R2=0.9999，淫羊藿苷在0.1～1.2μg之间线性关系良好。

2.1.5 样品测定 精密吸取供试品溶液与对照品溶液各10μL，注入液相色谱仪，依据2.1.1项下色谱条件，记录峰面积，采用外标一点法计算淫羊藿苷的含量。

2.2 醇浸出物得率的测定 精密吸取各浓缩定容至100mL的提取液10mL，置已干燥至恒重的蒸发皿中，水浴蒸干，于105℃烘箱内干燥至恒重，置干燥器中冷却30min，迅速精密称定重量。按公式计算醇浸出率：醇浸出物得率（%）=[浸膏重量×10/药材重量]×100%。

2.3 总黄酮含量测定

2.3.1 对照品溶液的制备 精密称取淫羊藿苷对照品适量，加甲醇制成每1mL含0.1mg的溶液，即得。

2.3.2 供试品溶液的制备 精密移取样品液1mL至10mL量瓶中，加甲醇稀释至刻度，摇匀，即得。

2.3.3 标准曲线的绘制 精密吸取淫羊藿苷对照品溶液 0.5、1.0、1.5、2.0、2.5mL 置具塞容量瓶中，分别加甲醇定容至10mL。以甲醇为空白参比，在270nm波长处测定吸光度。以吸光度A值对淫羊藿苷浓度C进行线性回归。结果表明：当淫羊藿苷的浓度在0.005～0.025mg/mL范围内，浓度与吸光度有良好的线性关系，回归方程为：A=50.789C-0.0120，R2=0.9992。

2.3.4 总黄酮含量测定 分别取供试品溶液和对照品溶液，以相应试剂甲醇为空白，照紫外-可见分光光度法，在270nm波长处测定吸光度值，代入标准曲线计算含量。

2.4 星点设计法优化提取工艺

2.4.1 试验设计及结果 根据星点设计的原理，选择影响醇提工艺的三个因素：乙醇浓度（X1）、 提取时间 （X2）、溶媒比（X3）进行考察，由于提取次数为非连续性数据，回归处理较为困难，故以单因素进行考察，最终确定提取次数为2次。上述三个因素每个设三个水平，用代码值-1、0、1来表示。因素水平见表1，实验安排和结果见表2。[5-6]

2.4.2 模型拟合 采用Design-Expert 8.0.6软件，对表2中数据以综合评分对自变量进行多元线性回归和二项式拟合，得多元线性回归：r=0.6426，P＜0.0001。由r值可以看出，拟合度不佳，因此线性模型不合适。得二项式拟合：r=0.9943，简化后的二项式方程为：Y=94.89-1.44X1+4.47X2+1.36X3+0.079X1X2+0.17X1X3-0.16X2X3-4.51X12-1.70X22+0.32X32，r=0.9839，相对于线性拟合模型有大幅度提高，表明该方程有较大可信度。拟合回归方程的方差分析结果见表3。

2.4.3 工艺优化与预测 固定3个变量中的一个为中值，再以拟合的目标函数为数学模型，绘制因变量曲面图。结果见图1～3。在图上选取提取较佳的工艺为——X1：68.96%，X2：8.12倍量，X3：117.58min。考虑到实验生产中的可操作性，选择乙醇浓度（X1）70%，溶剂用量（X2）8 倍量，提取时间（X3）120min 为最佳工艺条件。

表1 星点设计因素与水平

表2 星点试验设计与结果

表3 拟合回归方程的方差分析结果

图1 乙醇浓度与提取时间对提取效果的影响

图2 乙醇浓度与溶剂倍量对提取效果的影响

图3 溶剂倍量与提取时间对提取效果的影响

2.4.4 验证试验 按处方比例称取淫羊藿、杜仲药材3份，每份105g，加8倍量70%乙醇，提取2次，每次120min，测定淫羊藿苷含量、总黄酮含量及醇浸出物得率。结果表明：经优化后的工艺提取所得实测值与理论值接近，偏差在3%以内，所选工艺条件合理，稳定可行，见表4。

表4 验证试验结果

3 结论与讨论

淫羊藿中黄酮类成分是其发挥抗骨质疏松药理作用的主要有效成分，据统计，在治疗骨质疏松症的常用中药中，淫羊藿的使用频率居首位[7]。杜仲中含有大量的活性物质，成分复杂，但是化合物结构和性质相近，活性成分单体的提取分离较为困难[8]。杜仲能增强骨的力学性能，改善骨质量，从而能减少骨质疏松症骨折并发症的发生，同时也增加了骨量，促进骨形成。因此，在本方中结合淫羊藿、杜仲中所含成分的理化性质及现代药理研究结果，选择淫羊藿苷、总黄酮及醇浸出物作为综合评价指标，优选醇提的最佳工艺条件，其较单一指标更加科学合理。

本试验建立了淫羊藿苷含量、总黄酮含量及醇浸出得率的测定方法。通过星点设计-效应面法优选所得的最佳提取工艺为8倍量70%乙醇，提取2次，每次120min，提取预测值与理论值偏差为-1.14%，二项式拟合复相关系数r=0.9839。最佳条件下效应的预测值和实测值偏差较小，结果较好。

[1] 王俊勤，胡有谷，郑洪军，等.淫羊藿苷对体外培养成骨细胞增殖和分化的影响.中国临床康复，2002，6（9）：1307

[2] 马慧萍，贾正平，白孟海，等.淫羊藿总黄酮对大鼠实验性骨质疏松生化学指标的影响.中国药理学通报，2003，19（2）：187

[3] 肖静，李三华，莫宁萍，等.杜仲总黄酮对体外培养大鼠成骨细胞增殖的影响.遵义医学院学报，2008，31（3）：238

[4] 梁翔，彭太平，刘胜才，等.杜仲对大鼠骨髓基质细胞增殖及成骨分化影响的实验研究.江西中医学院学报，2007，19（3）：58

[5] 李瑾.太白楤木保肝活性部位的制备及其制剂前研究.咸阳：陕西中医学院，2012

[6] 郭东艳，覃鸿恩，唐志书，等.基于谱效相关的星点设计-效应面法优化太白楤木提取工艺.西北药学杂志，2012，27（5）：399

[7] 康学，刘仁慧，王秀娟.淫羊藿、女贞子抗骨质疏松症的应用与机制研究进展.中国实验方剂学杂志，2013，28（1）：332

[8] 刘慧，刘仲华，张盛.杜仲中活性成分的研究进展.农产品加工·学刊，2011（8）：12