通解口服液对MO D S模型大鼠回肠P P A R-γ、A P-1、N F-κB表达的影响

沈宇清 贾典荣 曹 云 顾志林

（南京中医药大学附属姜堰中医院，江苏姜堰225500）

多器官功能障碍综合征 （multiple organ dysfunction syndrome，MODS）是目前创伤、感染、休克等疾病最重要的死亡原因，目前医学界普遍认为胃肠道是MODS发病过程中受累较早的器官，胃肠黏膜缺血炎症反应是其重要的病理机制之一。近年有研究报道过氧化物酶体增殖物激活受体（PPAR-γ）是调节缺血炎症反应的重要作用靶点，而中药通过干预炎症反应的各个环节发挥着胃肠功能的保护作用。本院研发的通解口服液具有通里攻下、活血化瘀等作用，临床发现其对MODS患者急性胃肠损伤有防治作用[1]。为进一步研究通解口服液防治MODS急性胃肠损伤的机理，本实验通过建立MODS大鼠模型，观察通解口服液对MODS模型大鼠回肠组织PPAR-γ、激活蛋白-1（AP-1）、核转录因子 κB（NF-κB）表达的影响，探索MODS新的防治途径。

1 实验材料

1.1 动物 清洁级SD雄性大鼠48只，体重（190±20）g，由浙江省实验动物中心提供，合格证号：SCXK（浙）2008-0033。

1.2 药物 通解口服液（处方：大黄、蒲黄、败酱草、枳实、茜草各等份，药物浓度0.85g/mL）由泰州市姜堰中医院药剂科提供，批号：20130917，250mL/瓶。氨苄西林 （珠海联邦制药股份有限公司中山分公司），0.25g/粒，批号：30100304，以蒸馏水配成药液。兔抗鼠AP-1抗体（aN-20），美国Santa Cruz公司，批号：sc-12629；兔抗鼠NF-κB p65抗体，武汉博士德生物工程有限公司，批号：bs-0465R；兔抗鼠PPAR-γ抗体，武汉博士德生物工程有限公司，批号：bs-0530R；总蛋白试剂盒，中生北控生物科技股份有限公司，批号：20131117。

1.3 仪器 MP100型16导生理记录仪及其附件，美国BIOPAC公司；Synergy HT型紫外荧光酶标仪，美国Biotek公司；Olympus光学显微镜；瑞典产LKB-V超薄切片机；H-600日立型透射电镜；S-450型日立扫描电镜；HH数显恒温水浴锅，江苏金坛金城国胜实验仪器厂；ALC-MPA2000m型4导生理记录仪及其附件，上海奥尔科特仪器公司；R-911型全自动放免计数仪，中国药科大学实业总公司；7160型日本日立全自动生化分析仪。

2 实验方法

2.1 分组与给药 SD雄性大鼠随机分为6组：空白对照组、模型组（生理盐水 0.018g·kg-1·d-1）、阳性药物组 （氨苄西林0.4g·kg-1·d-1）和通解口服液低（8.5g·kg-1·d-1）、中 （17g·kg-1·d-1）、高 （34g·kg-1·d-1）剂量组，各组间体重无显著性差异。预先分别灌胃生理盐水或药物，连续给药2d，每日2次，最后一次灌胃给药48h后开始禁食不禁水，禁食12h后再灌胃给药1次后造模。

2.2 造模 给药后腹腔注射10%水合氯醛（3.0mL/kg）麻醉，舌下静脉注射脂多糖 （LPS）8mg/kg复制MODS急性胃肠损伤大鼠模型[2]。符合临床实际的MODS实验模型应具备的标准是：（1）损伤因素与临床MODS常见诱因基本一致；（2）发病在致伤24h以后；（3）有 SIRS 的临床表现；（4）有 2 个以上器官或系统的功能障碍；（5）有足够的发病率和死亡率。实验动物MODS的诊断依据与人类基本一致，即：诱因+SIRS+多器官功能障碍[3]。我们实验中大鼠出现生命体征变化，严重肝肾功能损伤，符合MODS诊断[4]。

2.3 指标检测 免疫组化法对回肠进行PPAR-γ、AP-1、NF-κB蛋白表达检测，建模6h后，各组大鼠麻醉后予脱颈处死，迅速取出回肠沿系膜缘剖开，去除内容物，PBS液漂洗，取上段回肠置于4%多聚甲醛固定，固定后的组织在PBS中漂洗5min×3次，上行脱水，将组织块放入二甲苯中5～30min，石蜡包埋，用石蜡切片机切片，厚度为5μm，进行免疫组化染色，显微镜下胞浆呈棕黄色颗粒视为阳性表达。每组取8个标本检测，应用Image-ProPlus6.0分析软件，每个标本选取肌层区域，计算所选区域的面积（area）和所选区域内免疫组化阳性信号总的灰度值的乘积，最后以每组均值进行比较。

2.4 统计学方法 使用SPSS13.0统计软件进行数据分析。计量资料以（±s）表示，采用 t检验。 P＜0.05，P＜0.01为差异有统计学意义。

3 实验结果

与空白对照组比较，模型组大鼠回肠组织PPAR-γ表达显著降低（P＜0.01），AP-1 表达显著升高 （P＜0.01），NF-κB 也表现增加趋势。与模型组比较，通解口服液低剂量组与阳性药物组大鼠PPAR-γ的改变不明显（P＞0.05），通解口服液中、高剂量可显著增加模型大鼠 PPAR-γ 的表达（P＜0.05，P＜0.01）；各给药组均可明显降低 AP-1、NF-κB 的表达（P＜0.05，P＜0.01）。与阳性药物组比较，通解口服液中、高剂量对于上述指标的改善更具优势（P＜0.05，P＜0.01）。 通解口服液各剂量组间比较，体现出一定的量效关系。见表1。

空白对照组大鼠回肠组织可见PPAR-γ阳性（呈棕黄色）表达，模型组、阳性药物组、通解口服液低剂量组大鼠PPAR-γ表达不显（呈浅黄色），通解口服液中剂量组大鼠PPAR-γ表达明显 （呈深黄色），高剂量组可见PPAR-γ阳性（呈棕黄色）表达。见图1。

空白对照组大鼠回肠组织未见AP-1阳性表达，模型组大鼠见AP-1阳性表达（呈棕黄色），阳性药物组和通解口服液低、中剂量组大鼠AP-1表达不明显（呈浅黄色），通解口服液高剂量组大鼠回肠组织未见AP-1阳性表达。见图2。

空白对照组大鼠回肠组织未见NF-κB阳性表达，模型组大鼠见NF-κB阳性表达（呈棕黄色）；阳性药物组和通解口服液低、中剂量组大鼠NF-κB阳性表达不明显（呈浅黄色），通解口服液高剂量组大鼠回肠组织未见NF-κB阳性表达。见图3。

表 1 各组大鼠回肠组织 PPAR-γ、AP-1、NF-κB 表达比较（±s）

表 1 各组大鼠回肠组织 PPAR-γ、AP-1、NF-κB 表达比较（±s）

注：与模型组比较，*P＜0.05，**P＜0.01；与阳性药物组比较，△P＜0.05，△△P＜0.01；与通解口服液低剂量组比较，※P＜0.05，※※P＜0.01。

组别 动物数（只）阳性药物组 8 1.06±0.42** 1.25±0.46*通解口服液低剂量组 8 1.50±0.53* 1.13±0.58*通解口服液中剂量组 8 0.94±0.56**△※ 0.81±0.26**△※剂量（mg/kg）PPAR-γ空白对照组通解口服液高剂量组 8 0.88±0.52**△△※ 0.69±0.26**△△※※- 2.50±0.53**- 1.63±0.52 0.4 1.63±0.74 8.5 1.75±0.71 17 2.25±0.71*△34 2.50±0.53**△△※AP-1 8 NF-κB 0.94±0.18**1.31±0.59模型组82.00±0.53 2.00±0.76

图1 各组大鼠回肠组织PPAR-γ表达的病理图片（HE，×400）

4 讨论

MODS是指机体遭受严重急性损伤后，由于失控的全身炎症反应，使机体在短时间内（＞24h）同时或序贯出现两个或两个以上系统器官功能障碍的临床综合征，而医学界普遍认为胃肠道是促发MODS的始动器官和靶部位。胃肠功能状态被认为是判断危重病人预后的一项重要指标。胃肠运动功能的恢复有助于有效阻断MODS的进一步发展。目前针对MODS胃肠功能损伤尚无特效药，临床上主要采用肠内营养、抑酸、改善肠动力等治疗，但疗效并不理想，因此采用中医药干预成为当前研究的热点。我们既往研究发现，通瘀解毒法有助于改善MODS患者胃肠功能，因此设计本实验做一次机理探索。

PPAR-γ是一类依赖配体激活的核转录因子，参与许多生理反应的调节，其生物学功能复杂多样，包括调控脂肪和糖代谢、脂肪细胞终末分化、抗肝纤维化作用，减轻细胞氧化应激损伤，保护脏器功能等。近年来研究发现，PPAR-γ及其激动剂在抗缺血再灌注损伤方面起着重要作用，是细胞炎症及缺血反应的重要调节因子[5]。PPAR-γ被其天然与合成配体激活后，可抑制炎性细胞因子白介素-1（IL-1）、IL-6及肿瘤坏死因子-α（TNF-α）等的分泌，抑制黏附因子ICAM-1及P-选择素、E-选择素等的表达，同时也能减少诱导型一氧化氮合酶（iNOS）的表达，从而发挥抑制炎症反应、改善血管内皮功能的作用。上述炎性因子的表达均依赖于转录因子：激活蛋白-1（AP-1）、核转录因子 κB（NF-κB）的活性而发挥作用，而活化的PPAR-γ可以抑制二者的活性。临床研究表明，MODS患者PPAR-γ活性明显下调[6]。脓毒血症及肠炎患者体内PPAR-γ表达减少，IL-1、IL-6及 TNF-α 表达水平较高[7-8]，特别是MODS患者。因此上调PPAR-γ的表达在MODS急性胃肠损伤的防治中有重要的意义。

图2 各组大鼠回肠组织AP-1表达的病理图片（HE，×400）

图3 各组大鼠回肠组织NF-κB表达的病理图片（HE，×400）

我们经过长期临床观察，发现MODS起病急骤，病情重笃，发生变证时多有毒，伤血动血败血甚者必有毒，病情顽固缠绵者常蕴毒，症见秽浊者则有毒。MODS的临床特点和病理演变符合中医学“毒”的特性，而急性胃肠功能损伤则是“热从毒化，变从毒起，瘀从毒结”的结果之一。我们抓住MODS急性胃肠损伤“毒瘀互结”的病理中心，以“六腑以通为用”之要义，确立了通瘀解毒的治疗大法，并研制出通解口服液应用于临床。通解口服液中大黄、败酱草解毒通瘀，既能清解热毒，又能化瘀通腑，共为君药；配伍枳实、蒲黄、茜草，达到疏与通合，清与散配，化瘀而不动血，止血而不留瘀的效果。既往研究发现通解口服液可改善MODS患者胃肠功能[9]，对MODS大鼠炎症反应具有明显的抑制作用[4]。本研究以回肠PPAR-γ、NF-κB和AP-1蛋白的表达为观察指标，评估通解口服液对PPAR-γ、NF-κB和AP-1调控作用。结果显示，各剂量的通解口服液均可上调MODS模型大鼠回肠组织PPAR-γ的表达，降低NF-κB和AP-1的表达，且以中、高剂量组改善程度更明显，认为通解口服液对MODS模型大鼠回肠组织 PPAR-γ、AP-1、NF-κB 表达的影响与其剂量有一定的相关性。通解口服液可能是通过激活抗氧化系统、抗炎、保护血管内皮等作用防治MODS。下一步我们将更深入地研究PPAR-γ、炎症因子与肠平滑肌细胞之间的相关性，从微观角度探讨通解口服液防治MODS胃肠损伤的作用靶点。

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[6] 汤石林，赵正亮，王桥生，等.脓毒症大鼠PPAR-γ与脂联素表达水平的相关性研究.海南医学，2012，23（3）：317

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[9] 席峰，曹云，沈宇清.通瘀解毒法“治未病”干预MODS的临床疗效评价.中医药临床杂志，2014，26（12）：1224