手术切口局部浸润罗哌卡因复合地佐辛超前镇痛对GM-CSF表达及切口愈合的影响

乔芬 程桥 凡浙录

手术切口的疼痛处理日益引起广泛关注[1-2]。为了术后更充分的镇痛，专家学者们根据术后疼痛的机制提出了多模式镇痛的方法。而切口部位的局部浸润麻醉是术后镇痛的常用方法，超前镇痛的理念也广泛应用于临床麻醉过程中。有研究证明，0.5%罗哌卡因局部浸润麻醉促进GM-CSF表达，利于伤口愈合[3-4]。而地佐辛作为一种阿片受体混合激动拮抗剂，镇痛效果强而不良反应少，用于临床麻醉即术前或术后镇痛[5-8]。但其对GM-CSF表达及伤口愈合的影响尚不明确。本实验拟研究地佐辛及两种药物复合使用对GM-CSF表达及伤口愈合的影响，为临床用药提供新的思路，现具体报道如下。

1 材料与方法

1.1 实验动物 健康清洁雄性昆明小鼠100只（由山西省肿瘤医院动物房提供），体重25~30 g，采用随机数字表法将小鼠分为生理盐水浸润组（NS组）、0.5%罗哌卡因局部浸润组（L组）、地佐辛术前腹腔注射组（D组）、0.5%罗哌卡因局部浸润复合地佐辛术前腹腔注射组（Y组），每组25只。将小鼠单笼饲养，每笼编号，依次为1~100号。

1.2 方法

1.2.1 切口痛模型制备 将小鼠腹腔注射6%戊巴比妥钠（0.01 mL/g）麻醉，俯卧位固定于具有保温设施的实验台，背部脱毛消毒，于背部近颈侧以脊柱为中线切除约0.8 cm×0.8 cm大小（约占体表面积的1.2%，由Meech-Rub-ner公式计算）皮肤全层切口。L组、D组、Y组分别于切皮前10 min皮下注射罗哌卡因（海南斯达制药有限公司）1 mL/kg，腹腔注射地佐辛（扬子江药业集团有限公司）5 mg/kg，皮下注射罗哌卡因1 mL/kg、腹腔注射地佐辛5 mg/kg。L组、D组、NS组不注射药物部分注射等剂量生理盐水。

1.2.2 创面愈合率及GM-CSF浓度测定 于伤后72 h在不同处理组中按完全随机原则分别选取20只小鼠，行颈椎脱位术将小鼠处死，处死后取小鼠组织前用相机拍摄创面，所得图像用Photoshop软件进行创面大小计算，以便测定伤后各组创面愈合率。照相后取材，切取包括4 mm的正常创缘的创面组织，超声波粉碎后，制成组织匀浆，将制备好的匀浆离心留上清液，采用双抗体一步夹心酶联免疫吸附法（ELISA）检测GM-CSF浓度（试剂盒购于北京四正柏生物科技有限公司），同时用BCA法测上清液蛋白浓度（试剂盒购于北京普利莱基因技术有限公司），为减小取材误差，以二者之比表示GM-CSF浓度进行比较，具体操作如下。

1.2.2.1 ELISA操作方法 （1）标准品液配制：使用前加入蒸馏水混匀，配成200 ng/mL的溶液。设标准管8管，第1管加标本稀释液900 μL，第2~8管加入标本稀释液500 μL，在第1管中加入200 ng/mL的标准品溶液100 μL混匀后用加样器吸出500 μL，移至第2管。如此反复做对倍稀释，从第7管中吸出500 μL弃去。第八管为空白对照。（2）10×标本稀释液用蒸馏水做1∶10倍稀释。（3）洗涤液：用重蒸水1∶20稀释。（4）加样：设空白孔1个，标准孔7个，待测样品54个。每孔各加入标准品或待测样品100 μL，将反应板充分混匀后置37 ℃ 120 min。（5）洗板：用稀释后洗涤液将反应板充分洗涤4次，向滤纸上印干。（6）每孔中加入第一抗体工作液100 μL。将反应板充分混匀后置37 ℃ 60 min。（7）洗板：再用稀释后洗涤液将反应板充分洗涤4次，向滤纸上印干。（8）每孔加入底物工作液100 μL，置37 ℃暗处反应15 min。（9）每孔加入100 μL终止液混匀。（10）30 min内用酶标仪在450 nm处测OD值。

1.2.2.2 ELISA测定结果的计算与判断 （1）所有OD值都应该减除空白值后再进行计算。（2）以标准品20、10、5、2.5、1.25、0.625、0.312、0 ng/mL 为横坐标，OD值为纵坐标，在坐标纸上作图，画出标准曲线。根据标准品及对应的OD值计算出标准曲线的回归方程，再根据样品的OD值在回归方程上计算出对应的样品浓度。

1.2.2.3 BCA法 （1）取0.8 mL蛋白标准配置液加入到一管蛋白标准（20 mg BSA）中，充分溶解后配置成25 mg/mL的蛋白标准溶液。（2）取适量25 mg/mL蛋白标准溶液，稀释至终浓度为0.5 mg/mL。（3）根据样品数量，按50体积BCA试剂A加1体积BCA试剂B（50∶1）配制适量BCA工作液，充分摇匀。（4）将标准品按 0、1、2、4、8、12、16、20 μL加到 96孔板的标准品孔中，加标准品稀释液补足到20 μL。（5）加适当体积样品到96孔板的样品孔中，加标准品稀释液到20 μL。（6）各孔加入200 μL BCA工作液，37 ℃放置30 min。（7）测定A562，540~595 nm之间的波长也可接受。根据标准曲线计算出样品的标准浓度。

1.3 观察指标 （1）创面愈合时间：每组未处死5只小鼠，记录创面达到完全愈合所需时间；（2）创面愈合率：创面愈合率=[（创面原有面积-各时相点创面测得面积）/创面原有面积]×100%；（3）GM-CSF表达：用ELISA法测得的GM-CSF浓度与BCA法测得的上清液蛋白浓度之比表示GM-CSF浓度。

1.4 统计学处理 采用SPSS 17.0统计软件处理数据，计量资料以（±s）表示，比较采用t检验，以P<0.05表示差异有统计学意义。

2 结果

2.1 四组小鼠创面愈合率及GM-CSF浓度比较 L、D、Y组切口愈合率、GM-CSF浓度均高于NS组，比较差异均有统计学意义（P<0.05）。D组切口愈合率、GMCSF浓度与L组比较差异无统计学意义（P>0.05）；Y组切口愈合率及GM-CSF浓度均高于L组且高于D组，比较差异均有统计学意义（P<0.05），见表1。

表1 四组小鼠创面愈合率及GM-CSF浓度比较（x-±s）%

2.2 四组小鼠切口愈合时间比较 NS、L、D、Y组的切口愈合时间分别为（17.8±1.30）、（12.0±1.23）、（11.6±0.89）、（9.8±0.87）d，L、D、Y 组切口愈合时间均较NS组短，比较差异均有统计学意义（P<0.05）。D组切口愈合时间与L组比较差异无统计学意义（P>0.05）；Y组切口愈合时间短于D组及L组，比较差异均有统计学意义（P<0.05）。

3 讨论

临床上罗哌卡因局部浸润和地佐辛静脉注射均可产生良好的镇痛作用，且有实验证明0.5%罗哌卡因局部浸润麻醉有促进伤口愈合的作用，而地佐辛对伤口愈合的影响不明确。GM-CSF是细胞中的粒细胞和巨噬细胞谱系的成熟和功能的重要调节剂，其参与了皮肤组织的创伤愈合，小鼠切口痛后72 h皮肤组织GM-CSF表达增加达峰值[9-11]。因此本研究选择0.5%罗哌卡因和地佐辛进行麻醉镇痛，术后72 h测定GMCSF浓度。

本研究结果表明，0.5%罗哌卡因术前局部浸润麻醉有促进GM-CSF表达的作用，地佐辛超前镇痛也有促进GM-CSF表达的作用且二者复合使用促进GMCSF表达的作用更佳，但0.5%罗哌卡因与地佐辛二者促进GM-CSF表达比较差异无统计学意义（P>0.05）。GM-CSF对伤口愈合的4个时相（止血、炎症反应、增殖和组织重塑）都有促进的作用[6]。（1）止血阶段：血管收缩，凝血级联反应的启动及所形成的止血栓共同起到了止血作用。已有报道从GM-CSF的注射部位打孔活检组织观察到GM-CSF注射部位的止血速度要比其他部位快。（2）炎症反应阶段：吞噬细胞需要清除存在于创面的坏死的物质，细胞的碎片和各种有害微生物。GM-CSF借以通过对中性粒细胞和巨噬细胞的增殖和活化能力的促进作用，来提高其吞噬活性还有其杀菌的能力，同时GM-CSF也可以刺激巨噬细胞分泌有利于创面愈合的一些细胞因子，如PDGF、FGF、TGF、EGF、VEGF等。（3）增殖阶段：胶原基质形成、肉芽组织形成及角质上皮增殖，爬行覆盖创伤表面及进一步分化。GM-CSF可刺激增加成纤维细胞中α-肌动蛋白的产生，而后者是肉芽组织形成所必需的。GM-CSF同时刺激新生角质化上皮的增殖反应。且在粒细胞-巨噬细胞集落刺激因子注射部位的表皮蛋白、角蛋白等物质产生均有所增加，而且这些蛋白的表达增加，正好是角质化上皮细胞迅速分化的结果。（4）组织重塑阶段：伤口收缩，胶原纤维有序重排和创口上皮的抗张力强度增加。粒细胞-巨噬细胞集落刺激因子不但可以使伤口的收缩增加，也可增强伤口周围组织的抗张力强度。研究证明，治疗用rhGM-CSF影响了溃疡性黏膜组织炎性细胞因子，降低了口腔黏膜溃疡，也对深Ⅱ度烧伤的伤口清创愈合有促进作用[9，12]。rhGM-CSF凝胶可促进糖尿病大鼠创面愈合，引起皮肤组织中微小RNA明显差异性表达，这可能是其促进创面愈合在基因转录后水平上的靶点，且对糖尿病伤口经促炎因子水平的上调及新毛细血管的生成，从而促进伤口愈合[13-14]。同时，GMCSF的应用可以减少胶原蛋白的沉积，减少瘢痕的形成且可对伤口重塑和促进声带再生[15-16]。本实验的研究结果表明，与生理盐水组比较，其他三组小鼠伤口痛模型72 h后，GM-CSF均增加，且伤口愈合时间缩短，伤口愈合率提高，比较差异有统计学意义（P<0.05）。推测为0.5%罗哌卡因局部浸润麻醉和地佐辛静脉注射可以促进GM-CSF的表达，进而促进伤口愈合。

综上所述，0.5%罗哌卡因术前局部浸润麻醉能促进GM-CSF表达，进而促进伤口愈合，地佐辛超前镇痛也能使GM-CSF表达增加并促进伤口的愈合且两者复合使用对GM-CSF表达及伤口愈合作用更佳。但0.5%罗哌卡因与地佐辛促进伤口愈合及GM-CSF表达的效果比较差异无统计学意义（P>0.05）。

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