以壳聚糖磷酸降解产物制作妇科医用敷料的抑菌实验研究*

王勋松 唐俊 黄秀珍 袁水斌 欧阳恭华

壳聚糖（Chitosan，CS）是甲壳素脱乙酰的产物，来源于甲壳动物和昆虫的外骨骼，在地球上含量极为丰富。作为自然界中广泛存在的一种天然多阳离子化合物，壳聚糖具有生物官能性和相容性、血液相容性、安全性、微生物降解性等多种优良性能，使其在各行各业中得到广泛关注。已有大量的研究提示，壳聚糖在体内、体外对金黄色葡萄球菌、表皮葡萄球菌、大肠埃希氏菌、铜绿假单胞菌、白色念珠菌等均有抑制作用[1]。本实验通过对壳聚糖进行磷酸降解制备低分子量壳聚糖磷酸降解产物，以壳聚糖磷酸降解产物制作两种水溶性妇科医用敷料，并同时对他们进行抑菌实验来研究低分子量壳聚糖磷酸降解产物及其妇科医用敷料的抑菌效果，现报道如下。

1 材料与方法

1.1 材料及设备 壳聚糖（脱乙酰度95%以上）、聚乙二醇400、聚乙二醇4000、聚乙烯醇及明胶均购自南通兴成生化有限公司，95%乙醇、磷酸均为分析纯。所用水为去离子纯水，水解酪蛋白液体培养基、水解酪蛋白固体培养基、真菌药敏培养基（RPMI 1640）及营养肉汤购自郑州博赛生物科技有限公司。隔水式电热恒温培养箱；THZ-95恒温振荡仪；浊度仪；低速离心机。标准菌株：大肠埃希菌（ATCC25922）、金黄色葡萄球菌（ATCC25923）、白色念珠菌（ATCC10231）均购自卫生部临床检验中心。

1.2 方法

1.2.1 低分子量壳聚糖磷酸降解产物的制备 （1）取一洁净烧杯，加入80 mL去离子水，然后加入20 mL磷酸，配成含20%磷酸水溶液。（2）取脱乙酰度为95%以上的壳聚糖10 g溶于100 mL的20%磷酸溶液（20 mL磷酸+80 mL水）中，混匀后，置于约85 ℃恒温振荡仪边搅拌边振荡混匀。2 h后，加入同等量的95%乙醇，搅拌混匀，这时有白色絮状物质析出，继续搅拌直到白色絮状物质不再析出为止。（3）在加热降解2 h后，将前面磷酸降解后的壳聚糖溶液分装到规格为1.5×10 cm的塑料试管中，每管5 mL，然后各管分别再加入5 mL无水乙醇，充分振荡搅匀后，析出白色絮状物质沉淀，放置低速离心机里3000 rpm离心5 min，离心完后取出试管将上清液倒弃，留下的沉淀物试管中再加入5 mL的无水乙醇，振荡混匀后，再3000 rpm离心5 min，如此洗涤3次后，弃去上清液后，将只剩有沉淀的塑料试管放置于37 ℃温箱底部让剩下的水分蒸发掉，烘干后试管倒出的粉末即为制备的低分子量壳聚糖磷酸降解产物。该产物粉末溶于水后pH为4.0。

1.2.2 医用栓剂敷料的制作 （1）称取低分子量壳聚糖酸解产物100 mg置于试管中，再加入20 μL磷酸和0.3 mL水，置于80 ℃水浴箱水热约10 min，待完全澄清后取出。（2）再分别称取聚乙二醇4000型1.2 g和聚乙二醇400型1.2 g加入前面试管中，继续放置80 ℃水浴加热，至澄清后取出。（3）然后立即用粗口径滴管吸取混合液滴到直径6 mm的每个微板小孔中2滴，待冷却后凝固成白色软固状物，即为壳聚糖酸解产物医用栓剂敷料实验用小块。

1.2.3 医用水凝胶式敷料的制作 （1）称取0.4 g低分子量壳聚糖磷酸降解产物置于玻璃试管中，加入20 μL磷酸和1 mL去离子水，搅匀后置于80 ℃水浴箱水浴10 min后，再用振荡仪振荡搅匀至完全溶解变透明溶液后取出。然后加入3 mL水和1 mL甘油，混匀。（2）称取0.8 g药用明胶加入到小烧杯中，再加入5 mL去离子水，放置80 ℃水浴箱水浴并不时搅拌，直到变成均匀悬浊液为止。（3）将上述两步的液体倒在一起混匀，再加入0.8 g聚乙烯醇，边加边搅拌配成均匀的混合液体，然后置80 ℃水浴箱水浴5 min形成凝胶状物质，即为可用壳聚糖酸解产物医用水凝胶敷料。

1.2.4 低分子量壳聚糖酸降解产物最小抑菌浓度测定 分别称取1024 mg的低分子量壳聚糖产磷酸降解产物，溶于1 mL无菌生理盐水中配成浓度为1024 mg/mL低分子量壳聚糖产磷酸降解产物原液。再对原液行对倍稀释使其最终浓度分别为512、256、128、64、32、16、8、4、2、1、0.5、0.25、0.125、0 mg/mL， 最 后一管为对照。分别加入0.05 mL的经培养18~24 h的1.5×106CFU/mL（0.5麦氏浊度稀释100倍）的金黄色葡萄球菌、大肠埃希菌和白色念珠菌菌悬液，混匀后放置35 ℃恒温培养箱中作用2 h后，再分别吸取0.05 mL混合液接种于普通琼脂培养基，白色念珠菌接种于沙保罗培养基中，把接种好的培养基放置35 ℃恒温培养箱中培养24 h，24 h后取出培养基读取结果，分别观察不同浓度的培养基的细菌菌落生长情况。以不生长形成菌落的浓度为最小抑菌浓度。

1.2.5 低分子量壳聚糖酸降解产物医用敷料的抑菌实验 分别在水解酪蛋白固体培养基（M-H培养基）和真菌药敏专用培养基（RPMI 1640培养基）用金属打孔器打3个直径6 mm的圆形凹杯孔，M-H培养基涂布制备好的0.5麦氏浊度的金黄色葡萄球菌、大肠埃希菌菌悬液，RPMI 1640培养基涂布0.5麦氏浊度白色念珠菌菌悬液。然后一孔加入低分子量壳聚糖酸降解产物医用栓剂敷料一片，一孔加入低分子量壳聚糖酸降解产物医用水凝胶敷料0.1 mL，第3孔做对照。把抑菌实验的培养基放置于35 ℃恒温培养箱中培养24 h，培养24 h后观察3个孔周围的细菌生长情况，以无细菌生长的最大直径为抑菌直径。测定低分子量壳聚糖酸降解产物医用敷料对细菌的抑菌环直径，用以判断低分子量壳聚糖酸降解产物医用敷料的抑菌效果。

2 结果

2.1 壳聚糖酸降解产物最小抑菌浓度 通过肉汤稀释法测定低分子量壳聚糖酸降解产物对金黄色葡萄球菌的最小抑菌浓度为0.25 mg/mL，对大肠埃希菌的最小抑菌浓度为0.25 mg/mL，对白色念珠菌的最小抑菌浓度都为0.5 mg/mL。

2.2 壳聚糖磷酸降解产物敷料的抑菌效果 经过24 h培养后，药敏培养基上低分子量壳聚糖酸降解产物医用栓剂敷料和医用水凝胶敷料在金黄色葡萄球菌、大肠埃希菌和白色念珠菌培养基的小孔周围形成比较清晰的抑菌环，两种低分子量壳聚糖磷酸降解产物制备的医用敷料对标准菌种的抑菌环直径见表1。

表1 两种医用敷料对标准菌株的抑菌环直径 mm

3 讨论

壳聚糖的抑菌作用是保证壳聚糖抑菌敷料临床应用疗效的前提和关键。近年来，随着科学的发展，人们对壳聚糖的抑菌机制的认识有了长足的进步；壳聚糖抑菌机制：（1）干扰菌体细胞膜功能，这种机制主要对革兰氏阳性菌起主导作用。（2）还可以直接与菌体DNA和mRNA作用。Liu等[2]在测试壳聚糖的抑菌能力的实验中，用FITC（异硫氰酸荧光素）来标记低分子质量的壳聚糖，并与大肠杆菌一起培养；结果经过荧光检测发现，在大肠杆菌的胞体内存在大量被标记的分子质量为8000 u和4000 u的壳聚糖。推测可能是由于低分子质量的壳聚糖可以通过渗透的方式进入到细菌的胞体内，带正电荷的壳聚糖与带负电荷的DNA相互作用，影响RNA的转录和蛋白质的合成，达到抑菌的目的。（3）激活几丁质酶，壳聚糖作为几丁质酶的底物，在其大量存在的条件下，病原真菌的几丁质酶的活性可以被激发出来。对于大多数病原真菌来讲，当壳聚糖浓度很高时，病原真菌体内的几丁质酶就被过分的表达，从而降解其自身细胞壁的几丁质，导致细胞壁损坏，发挥抑菌效果[3]。（4）通过氨基起抑菌作用，王鸿等[4]在不同脱乙酰度的壳聚糖的抑菌研究中，认为壳聚糖的抑菌作用可能是通过其带正电荷的氨基与细菌的细胞壁结合，阻碍细菌增殖来实现的。革兰氏阴性菌的细胞壁的最外层是一层较厚的类脂多糖，有吸附阳离子的作用；当其吸附了质子化的壳聚糖后，与Ca2+结合的机会就减少，脂多糖结构的稳定性变差，内壁层肽聚糖暴露出来容易被溶菌酶水解。

本研究通过肉汤稀释法测定低分子量壳聚糖酸降解产物对金黄色葡萄球菌的最小抑菌浓度为0.25 mg/mL，对大肠埃希菌的最小抑菌浓度为0.25 mg/mL，对白色念珠菌的最小抑菌浓度都为0.5 mg/mL。大大的提高了原有壳聚糖的抑菌能力，比单纯无降解的大分子壳聚糖的最小抑菌浓度大大降低，说明低分子量壳聚糖酸降解产物对细菌和真菌都有很强的抑制能力，具有广谱的抗菌能力，同时低分子量壳聚糖酸降解产物的水溶性和脂溶性都能大大提高壳聚糖的应用。这是因为分子质量是影响壳聚糖抑菌作用的重要因素，许莹等[5]发现低分子量壳聚糖（分子质量为1.7 ku）抗菌效果最明显，其对金黄色葡萄球菌和大肠杆菌的抗菌率有显著增加。低分子量壳聚糖对革兰氏阴性菌的抑菌活性也随分子质量的降低而升高[2]。郑连英等[6]也得出同样的结论，指出分子质量小于5 ku时，壳聚糖抗菌性最强。壳聚糖抑菌活性与pH值成反比关系。pH值升高，壳聚糖的溶解性和质子化程度降低，抗菌性逐渐降低。反之，壳聚糖分子所带正电荷增加，使其抑菌活性增加。在pH酸性溶液中，壳聚糖成为阳离子型生物絮凝剂，导致菌体新陈代谢紊乱，起到杀菌、抑菌作用。当pH值小于6时，壳聚糖具有显著的抑菌效果。而在中性及碱性条件下壳聚糖溶解性较差，不具有杀菌能力[7]。No等[8]系统研究了不同pH值对壳聚糖抗菌活性的影响，得出壳聚糖的抑菌活性在pH值为3时达到最高值，随着pH值的升高而逐渐降低。pH值大小对不同真菌的敏感性也存在差异。总之，pH值在酸性范围时有助于激发壳聚糖的抗菌性。而低分子量壳聚糖磷酸降解产物因为有磷酸化降解过程，制备的产物具有水溶性和脂溶性而且水溶后pH值可达到4.0，所以大大的提高了壳聚糖的抑菌能力，与文献[9]报道相符。

低分子量壳聚糖磷酸降解产物医用栓剂敷料和医用水凝胶敷料对金黄色葡萄球菌、大肠埃希菌及白色念珠菌的抑菌环直径分别为13、13、11 mm和14、14、12 mm。说明低分子量壳聚糖磷酸降解产物衍生医用栓剂敷料和医用水凝胶敷料都对细菌及真菌具有明显的抑制作用，具有广谱抗菌作用。制备妇科医用敷料在临床有广泛的应用前景。由于阴道和宫颈口生理结构的特殊性，面对妇科常见的生殖道感染，使用抗菌药物和外用清洗液常不能获得立即的效果[10]；同时，抗菌药物过多过频使用常导致耐药菌的增多，部分抗菌药物药效下降；过多的清洗阴道，常导致阴道内正常菌群失调，条件致病菌过渡增殖导致感染[11]。具有抑菌活性的低分子量壳聚糖磷酸降解产物制作妇科医用敷料的应用将有效解决这一问题，阴道的酸性环境（pH 3.8~4.4）也为其抑菌活性的发挥提供了最佳环境[12]。本研究将自然界广泛来源的甲壳素，即高乙酰化的壳聚糖经磷酸法降解的产物与聚乙二醇、明胶等其他成分制成不同形式的妇科医用敷料，并观察不同敷料的抑菌效果，旨在为慢性宫颈炎、BV和VVC等生殖道感染性疾病的治疗提供参考，这对减少抗菌药物的使用，减少细菌、真菌耐药的产生具有积极意义[13]。壳聚糖磷酸降解产物敷料的应用将有效减少宫颈癌术后切口和宫颈癌放疗过程中感染的发生，促进手术切口或溃疡口的愈合，为女性生殖道感染的治疗提供了新思路[14]。

总之壳聚糖磷酸降解产物具有强大的广谱抗菌性能，以低分子量壳聚糖磷酸降解产物制作妇科医用敷料具有巨大的市场及经济效益，值得大力推广应用。

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