含γ-氨基丁酸水牛酸奶对SHR大鼠血压、血脂及小鼠醉酒的影响

谢 芳，杨承剑，唐 艳，农皓如，杨小梅，曾庆坤*

（中国农业科学院广西水牛研究所，广西 南宁 530001）

γ-氨基丁酸（γ-aminobutyric acid，GABA）是一种非蛋白质氨基酸，广泛存在于自然界中，包括微生物、植物和动物[1]。GABA具有抗惊厥、抑制神经兴奋、舒缓血管和降血压[2]的生理功能，已经在大量的动物实验和临床医学中得以证实[3]。但除口服GABA具有明显降血压功能外，其他生理功能特性仍缺乏权威的人群实验数据，结论并不明确[4]。随着人民生活水平的提高，高血压、高血脂、肥胖等心脑血管疾病已经成为危害人类健康的主要因素[5]。有研究表明高血压、高脂血症是主要且可控的因素，它们之间的发生发展互为因果[6]。GABA作为一种新资源食品[7]，其应用前景非常广泛，就GABA功能性乳制品而言，其生产后须以产品为载体，在已有成果的基础上，展开更多的动物实验和人群实验，从而确证GABA的多重生理功效，并制定GABA摄入标准[8]。水牛乳作为南方地区特有的乳制品，营养价值颇高，其脂肪、蛋白质、乳糖的含量是黑白花牛奶的数倍，矿物质和维生素含量也是黑白花牛奶和人乳的数十倍[9]。利用水牛乳制成的酸奶，不但保留了水牛奶的所有营养，还补充了人体所需的大量益生菌，可以说是奶中极品。我国卫生部规定GABA摄入量不得超过500 mg/d[10]。欧洲食品安全局（European Food Safety Authority，EFSA）和美国食品药品管理局（Food and Drug Administration，FDA）承认乳酸菌发酵生产的GABA为天然食品添加剂[11]。

本研究中所涉及到的GABA均源自水牛乳中分离出的乳酸乳球菌发酵所得，是安全可行的食品微生物添加剂。将其产GABA的乳酸菌应用到酸奶发酵中，研制出富含GABA的水牛乳酸奶，并运用它来开展动物实验，通过连续灌胃给自发性高血压（spontaneously hypertensive rats，SHR）大鼠，来观察其降血压、调节血脂机理及降低酒精对动物神经系统损伤等作用，为今后功能性水牛乳产品的加工研究提供理论依据，并在提高GABA生物利用率的基础上明确量效关系，将为GABA功效验证提出新的研究思路[11]。

1 材料与方法

1.1 材料与试剂

2月龄雄性SHR 20只，正常雄性WKY（Wistar-Kyoto）大鼠10只，体质量（200±20）g，由北京维通利华实验动物技术有限公司提供；昆明小鼠（Kunming mice，KM）：由北京维通利华实验动物技术有限公司提供。

水牛乳：取自广西水牛研究所种牛场，灭菌后备用。保加利亚乳杆菌、嗜热链球菌：购自中国微生物菌种保藏中心，经活化传代后备用。乳酸乳球菌：从水牛乳中分离所得，为本实验室保藏。谷氨酸钠（纯度＞99%）：北京蓝博斯特生物技术有限公司。

二锅头清香型白酒（56°，100 mL/瓶）：北京红星股份有限公司。

普通酸奶（对照组）为全脂灭菌水牛乳添加5%的保加利亚乳杆菌∶嗜热链球菌（1∶1）混合菌种发酵而成；γ-氨基丁酸（GABA）酸奶（实验组）为5%的乳酸乳球菌[1]、保加利乳杆菌和嗜热链球菌（1∶0.5∶1）混合菌种，另加3%的乳酸乳球菌乳酸亚种菌种（Lactococcus lactissubsp.Lactis）及6‰的谷氨酸钠于全脂灭菌水牛乳中发酵而成，其中GABA的含量为3.6 g/L。

1.2 仪器与设备

ALC-NIBP无创血压测定分析系统：上海奥尔科特生物科技有限公司；TBA-A0FRACCUTE7100型日立全自动生化分析仪：日本东芝三广医疗株式会社；ML-54电子分析天平：美国梅特勒-托利多公司；DDL-5低速冷冻多管离心机：上海安亭科学仪器厂。

1.3 实验方法

1.3.1 降血压实验

分组及酸奶灌胃前1 d，利用无创动物血压分析系统测量SHR大鼠血压，作为灌胃前数据。根据血压基础值将20只SHR大鼠随机分为模型对照组、富含GABA水牛乳酸奶组，酸奶中GABA的含量为3.6 g/L。10只WKY大鼠作为正常对照组。所有组在自由采食（饲料）的同时，酸奶均采用灌胃给药，正常组大鼠灌胃普通酸奶，GABA酸奶组灌胃GABA水牛乳酸奶，模型组SHR鼠灌胃生理盐水，进给药量为10 mL/kg体质量，每天一次。测定大鼠尾部动脉血压，均在大鼠清醒、安静状态下进行，保持室温在22 ℃，给压脉圈皮囊充气将鼠尾套放置于鼠尾的根部，待大鼠脉搏基线稳定，连续3次充气读数，取其平均值[12]，连续测量6周。

1.3.2 调节血脂实验

实验开始前测定所有动物血脂，灌胃4周后再测定所有动物血脂。于末次测量血压后麻醉大鼠，腹主静脉取血5 mL，静置30 min，用低速离心机3 000 r/min离心15 min，取血清测量总胆固醇（total cholesterol，TCHO）、甘油三脂（triglyceride，TG）、高密度脂蛋白胆固醇（high density lipoprotein cholesterol，HDL-c）和低密度脂蛋白胆固醇（low-density lipoprotein cholesterol，LDL-c）[13]。

1.3.3 酒精翻正反射实验

KM小鼠30只，分成空白、对照、实验3组，每组10只，空白组灌胃生理盐水，对照组灌胃普通酸奶，实验组灌胃γ-氨基丁酸（GABA）酸奶，连续灌胃7 d后禁食12 h，分别灌胃给予56°白酒0.12 mg/10 g或0.15 mg/10 g体质量，以小鼠翻正反射（loss of therighting reflex，LOR）现象消失并持续30 s为醉酒指标。观察小鼠醉酒状况，并记录各组翻正反射消失小鼠的只数和时间及翻正反射恢复所需的时间。

1.3.4 数据分析

2 结果与分析

2.1 连续灌胃GABA水牛乳酸奶对SHR血压的影响

各实验组大鼠灌胃给药，给药量为10 mL/kg体质量，每天一次，连续灌胃6周后，测得SHR大鼠收缩压、舒张压、动脉压以及心率变化情况，结果分别见表1～表4。

表1 各组大鼠连续灌胃6周收缩压(SBP)的变化情况(n=8)Table 1 Changes of SBP of rats in each group after successive administration for six weeks (n=8)mmHg

由表1可知，灌胃前1 d，模型组对照组的收缩压（systolic blood pressure，SBP）水平均高于正常对照组（P＜0.05）。连续灌胃6周后，GABA水牛乳酸奶组与模型对照组比较具有显著差异（P＜0.05），其SBP明显下降，说明GABA水牛乳酸奶能有效降低SHR鼠的收缩压，特别是在第4～6周，其SBP下降较明显（P＜0.05）。

表2 各组大鼠连续灌胃6周舒张压(DBP)的变化情况(n=8)Table 2 Changes of DBP of rats in each group after successive administration for six weeks (n=8)mmHg

由表2可知，灌胃前1 d，GABA水牛乳酸奶组和模型对照组的舒张压（diastolic blood pressure，DBP）明显高于正常对照组（P＜0.05），连续灌GABA水牛乳酸奶后，GABA水牛乳酸奶组与模型对照组比较具有显著差异（P＜0.05），其DBP的数值显著下降，说明GABA水牛乳酸奶能有效降低SHR鼠的舒张压。

表3 各组大鼠连续灌胃6周平均动脉压(MBP)的变化情况(n=8)Table 3 Changes of MBP of rats in each group after successive administration for six weeks (n=8)mmHg

表4 各组大鼠连续灌胃6周心率(HR)的变化情况Table 4 Changes of HR of rats in each group after successive administration for six weeks次/min

由表3可知，灌胃前1 d，GABA水牛乳酸奶组和模型对照组的平均动脉压（mean arterial pressure，MBP）明显高于正常对照组（P＜0.05），连续灌GABA水牛乳酸奶后，其平均动脉压（MBP）在第2周时开始下降，整个实验中其平均动脉压（MBP）显著下降，GABA水牛乳酸奶组与模型对照组比较具有显著差异（P＜0.05），说明GABA水牛乳酸奶对SHR鼠的具有降血压作用。

大鼠的心率一般比小鼠慢，生理状况下的大鼠心率不会低于200 次/min，通常在400～600次/min之间，正常情况下，心率越高，血压、血脂越高[14]。由表4可知，灌胃前1 d，GABA水牛乳酸奶组和模型对照组的心率（HR）明显高于正常对照组（P＜0.05），经过灌胃GABA水牛乳酸奶后，GABA水牛乳酸奶组与模型对照组比较，其心率明显减慢（P＜0.05），说明GABA水牛乳酸奶能有效缓解大鼠心率过速。

2.2 连续灌胃GABA酸奶对CHOL、TG、HDL-c、LDL-c水平的影响

连续灌胃GABA酸奶，实验第4周后，分别于末次测量血压后麻醉大鼠，腹主静脉取血5 mL，静置30 min，用低速离心机3 000 r/min，离心15 min，取血清测量CHOL、TG、HDL-c、LDL-c[4]，结果见表5。

表5 GABA水牛乳酸奶对各组大鼠血脂的影响(n=12)Table 5 Effcet of GABA buffalo milk yogurt on blood lipid of rats in each group (n=12)mmol/L

由表5可知，GABA水牛乳酸奶组和模型对照组与正常对照组比较，血清的TG、LDL-c、HDL-c值均较高，差异有显著性（P＜0.05），说明高血脂建模成功，与正常组比较，GABA酸奶组的血清HDL-c、TG值显著降低（P＜0.05），差异有统计学意义，说明酸奶中的GABA能有效控制SHR大鼠的TG、HDL-c升高。不论与正常对照组还是模型对照组相比较，GABA酸奶组的血清甘油三脂（TG）值都明显降低（P＜0.05），这说明在连续灌胃4周后，GABA水牛乳酸奶能有效降低SHR大鼠血清中的甘油三脂（TG），即GABA水牛乳酸奶具有降脂作用。

2.3 GABA水牛乳酸奶对小鼠的酒精翻正反射实验

当提前7 d给KM小鼠灌胃GABA酸奶后，再灌胃白酒，GABA酸奶对小鼠酒精翻正反射消失及恢复时间的影响，结果见图1。

根据文献报道，小鼠灌酒后取其仰卧位，以小鼠仰卧位能持续30 s即认为其翻正反射消失（称为醉酒）[15]。由图1可知，GABA酸奶组与普通酸奶组及空白对照组比较，其酒精反射消失的时间最长，反射恢复的时间最短，这说明，富含GABA的水牛乳酸奶能显著延长白酒所致小鼠翻正反射消失（即醉酒）时间，还能明显缩短小鼠的反射恢复（即醒酒）时间，即GABA酸奶组小鼠能比其他组小鼠早醒酒。

图1 GABA酸奶对小鼠酒精翻正反射消失及恢复时间的影响Fig.1 Effcet of GABA buffalo milk yogurt on vanish and recovery time of righting reflex

3 结论

本试验将从水牛乳中分离出的高产GABA乳酸菌——乳酸乳球菌，应用到水牛乳酸奶的发酵中，研制出富含GABA的水牛乳酸奶，将其灌胃给SHR模型鼠，连续6周，每周平行测量大鼠收缩压、舒张压、平均动脉压，并于第4周末次灌胃后测定其血清甘油三酯、高密度胆固醇、低密度胆固醇、总胆固醇，结果表明，通过连续灌胃GABA水牛乳酸奶（酸奶中GABA的含量为3.6 g/L）4周以上，便能显著降低SHR鼠的血压、血脂。本研究GABA酸奶具有解除对动物神经细胞毒性试验，提前一周对KM小鼠灌胃GABA水牛乳酸奶，待其体征稳定后再灌胃56°白酒，由小鼠翻正反射试验结果表明，GABA水牛乳酸奶可明显延长小鼠的醉酒时间和缩短小鼠的醒酒时间，具体表现在推迟小鼠翻正反射消失时间和缩短小鼠翻正反射恢复时间，说明GABA水牛乳酸奶具有预防小鼠酒精中毒即解酒作用。

[1]谢 芳，曾庆坤，杨承剑，等.水牛乳中高产γ-氨基丁酸乳酸菌的筛选与鉴定[J].中国酿造，2015，34（4）：102-104.

[2]杨胜远，陆兆新，吕风霞，等.γ-氨基丁酸的生理功能和研究开发进展[J].食品科学，2005，26（9）：546-549.

[3]北京医学院基础部.中枢神经介质概论[M].北京：科学出版社，1977.

[4]VAN DER WOUW M.Future product development[R].Emerging Ingredients in functional soft drinks-analyzing market data,new product development,patents,clinical trials,and regulatory progress BI0062—001.Hongkong:Datamonitor Business Insihgts,2012.

[5]张俊秀，杨解人，唐丽娟，等.复方山菊对自发性高血压大鼠血压、血脂及全血黏的度的影响[J].皖南医学院学报，2011，30（1）：15-17.

[6]吴应红，周晓芳.高血压与高脂血症的相关性[J].实用医院临床杂志，2011，5（8）：162-164.

[7]许建军，江 波，许时婴.γ-氨基丁酸（GABA）-一种新型的功能食品因子[J].食品工业科技，2003，24（1）：109-110.

[8]SPOERRI P E,SRIVASTAVA N,VEMADAKIS A.Ethanol neurotoxicity on neuroblast-enriched cultures from three-day-old chick embryo is attenuated by the neuronotrophic action of GABA[J].Int J Dev Neurosci,1995,13(6):539-544.

[9]章纯熙.中国水牛科学[M].南宁：广西科学技术出版社，2000.

[10]中华人民共和国卫生部.中国人民共和国卫生部2009 年第12 号公告[EB/OL].北京：人民卫生出版社，2009.http：//www.moh.gov.cn/publicfiles/business/htmlfiles/zt09070801/s7653/200910/44174.htm.

[11]梁恒宇，邓立康，林海龙，等.新资源食品—γ-氨基丁酸（GABA）的研究进展[J].食品研究与开发，2013，34（8）：119-123.

[12]陈 琦，陈素红，吕圭源，等.芍药提取物对老年自发性高血压大鼠血压、血脂以及肝功能的影响[J].淅江中医药大学学报，2013，37（2）：187-188.

[13]吴秀川，牟 琴，于志瀛.尿毒清对老龄自发性高血压大鼠血压、血脂及血黏度的影响[J].中国中西医结合肾病杂志，2014，15（9）：800-802.

[14]肖 杭，恽时锋，刘年双.实验动物科学基础知识问答[M].南京：江苏科学技术出版，2004.

[15]谷 峰，汪德清，邓心新，等.枳葛片对急性酒精中毒小鼠翻正反射及血液中各项生物化学参数的影响[J].中国临床康复，2005，9（11）：134-135.