一种山东地栽香菇病害病原菌的分离及鉴定*

兰玉菲，蔚承祥，王庆武，崔 晓

（山东泰安市农业科学研究院，山东 泰安 271000）

〈病虫害防治〉

一种山东地栽香菇病害病原菌的分离及鉴定*

兰玉菲，蔚承祥，王庆武，崔 晓

（山东泰安市农业科学研究院，山东 泰安 271000）

从山东肥城采集到香菇病害样品，分离得到病原菌分离物FC，提取其基因组总DNA，利用真菌通用引物ITS1/ITS4扩增其rDNA ITS区域序列并进行测序。将获得的序列进行同源性比对和构建系统进化树，发现FC分离物与GenBank中8个米根霉（R.oryzae）分离物同源性最高，为98．27%，结合形态学特征，证明该分离物为米根霉（R.oryzae）。

香菇；病害；ITS；分子鉴定

香菇 [Lentinula edodes(Berk．)Sing．]又名香信、冬菇，其味道鲜美、营养丰富，含有较高的蛋白质、氨基酸、维生素以及矿质元素，素有山珍、菇中之王等美称[1]，具有增强免疫力、抗肿瘤、降血压、降血脂、保肝护肝等药用功效[2]。据中国食用菌协会统计2013年全国香菇产量达710．32万t，是年产量最大的品种，产量比2012年增长11．78%。

近年，通过对山东省香菇主产区进行病害调查，在地栽香菇大棚中发现了一种新病害，该病害一旦发生，菌棒就不再出菇，给地栽香菇生产造成了严重损失。本研究对该病的病原菌进行分离鉴定，以期为病害的防控提供依据。

1 材料与方法

1.1 样品采集

供试样品采自山东肥城市边院镇过村，栽培模式为大棚内覆土地栽，品种为香菇931，代料栽培原料主要为棉籽壳和木屑。

1.2 主要试剂

真菌总DNA提取试剂盒（E．Z．N．A．@ FungalDNA Kit）购自北京全式金公司；PCR所用试剂均为大连宝生物公司产品。常规试剂为进口分装或国产分析纯试剂。

1.3 病原菌的分离纯化

将采集的病原菌在无菌环境下接种于涂布有2滴～3滴乳酸（浓度为25%）的PDA培养基中，置于25℃黑暗培养。待菌丝萌发后，进行3次纯化获得其纯培养物，保存备用。

1.4 病原菌的形态学鉴定

将分离的病原菌接种于PDA培养基上，置于25℃恒温黑暗培养。采用十字交叉法测量菌落直径，计算菌丝日生长速度，观察并记录初生菌丝颜色、菌落颜色变化、表面特征、有无色素产生等。参照方水琴[3]的方法挑取菌株产孢器及菌丝制成水封片，利用显微成像系统（Olympus BX41） 观察孢子形态和大小、菌丝特征及分支情况等，并拍照。

1.5 病原菌的分子生物学鉴定

参照兰玉菲[4]的方法制备病原菌菌丝体；利用真菌总DNA提取试剂盒提取其基因组总DNA；参照White[5]所报道的用于真菌ITS区域扩增的通用引物ITS1/ITS4进行PCR扩增，PCR反应体系和程序参照兰玉菲[4]；PCR结束后，取4 μL反应液进行琼脂糖凝胶电泳，检测扩增结果，将有目的条带的PCR产物送北京博尚生物公司测序；将所得DNA序列输入GenBank进行 Blast检 索 ， 采 用 Clustalx1．81、DNASTAR、DNAMAN和MEGA 5软件对所得到的核苷酸序列与GenBank中收录分离物的相应序列进行比较和分析，并构建系统进化树。

2 结果与分析

2.1 病原菌的形态特征

发生在菇棚中的病害症状见图 1。分离纯化获得的病原菌菌株的形态特征观察结果见图2。

图1 拟鉴定的病害症状Fig．1 Symptoms of Lentinula edodes disease

图2 病原菌菌株的形态特征观察Fig．2 An observation on morphological characters of strain FC

分离纯化获得的病原菌（编号为FC） 在PDA培养基上菌落初为白色，无定形，气生菌丝发达，呈棉絮状；后期产生黑色小颗粒，菌丝呈灰色，2 d～3 d即可长满整个平板（图2A）；培养5 d后显微观察可见菌丝白色透明，无横隔（图2B），孢囊梗丛生，不分支，有假根（图2C），孢子囊顶生，球形或近球形，深褐色（图2B、图2D），孢囊孢子呈卵形、球形或近球形，大小不等，淡褐色（图2E）。

2.2 病原菌ITS基因的扩增

FC菌株ITS区PCR扩增结果见图3。

以提取的病原菌总DNA为模板，经PCR扩增，得到长度约为600 bp的目的片段。

2.3 病原菌ITS的序列同源性及系统发育分析

图3 病原菌菌株ITS区PCR扩增Fig.3 PCR amplification of rDNA ITS region of strain FC

序列测定结果表明，扩增产物长度为604 bp（GenBank登录号为KT222809），其中包括13 bp 18S rDNA基因序列、199 bp内转录间隔区 1（ITS1）、155 bp 5．8S编码序列、210 bp内转录间隔区2（ITS2）和27 bp的28S rDNA。Blast分析显示，FC与多株Rhizopus oryzae菌株最大相似性达100%。以黑曲霉（Aspergillus niger） 为外组，构建系统发育树，结果表明FC分离物与GenBank中下载的8个米根霉（R.oryzae）分离物和4个戴尔根霉（R. delemar）分离物聚为一簇。同源性比对结果表明FC分离物与8个米根霉分离物同源性为98.27%；而与戴尔根霉4个分离物同源性为93.87%；与少孢根霉（R.microsporus）2个分离物的同源性为86.43%；与匍枝根霉（R.stolonifer） 分离物的同源性最低，为85.09%。FC分离物与引起甜菜根腐病病原菌（KJ744361） 的ITS核苷酸一致率达到100%，而与引起桑树根部腐烂的致病菌（JN003653） 核苷酸一致率为98.76%，综上说明该分离物为米根霉（R.oryzae）。

图4 基于ITS序列构建的系统发育树Fig.4 Phylogenetic tree based on the ITS sequences and constructed using the Maximum Likelihood method

3 讨论

本研究从山东肥城市边院镇香菇大棚中分离到真菌菌株FC，对该病原菌的ITS序列与GenBank中的ITS序列进行BLAST比对，并构建系统发育树，结合病原菌形态特征，将其鉴定为米根霉（R.oryzae）。FC分离物与引起甜菜根腐病病原菌（KJ744361）的ITS核苷酸一致率达到100%。

根霉属（Rhizopus）属于接合菌亚门（Zygomycotina） 接合菌纲（Zygomycetes） 毛霉目 （Mucorales）毛霉科（Mucoraceae）[6]。根霉为喜高温的竞争性杂菌，广泛分布于空气、水塘、土壤及有机残体中，菌丝能分解吸收富含淀粉、糖分等速效性养分基质。熟化的培养基在高温期间接种和发菌时极易遭受侵害。香菇菌丝能在被根霉侵染过的培养基中继续生长，但养分吸收不完全，菌棒板结，开袋后转色困难[7]。根霉是香菇代料栽培中主要污染真菌之一，分离频率为4.08%[8]，而危害食用菌的主要为黑根霉 [R.stolonifer（Ehrenb:Fr.Vuill）][6]。本研究分离纯化到的FC分离物通过形态学和分子生物学鉴定结果发现病原菌为米根霉，与GenBank中的2个匍枝根霉（R.stolonifer） ITS同源性仅为85.09%，这说明米根霉对食用菌生产也可产生危害，生产中应加以预防和控制。

[1]黄年来.中国香菇栽培学[M].上海：上海科学技术文献出版社，1994.

[2]赵妍，林锋，宋春艳，等.香菇主要育种技术研究进展[J].生物学杂志，2015，32（2）：92-95.

[3]方水琴，吴福安，陈明胜，等.一种引起成年桑树根部腐烂的病害及致病菌分离与初步鉴定[J].蚕业科学，2011，37（5）：785-791.

[4]兰玉菲，安秀荣，王庆武，等.一种鸡腿菇病害病原菌的分离及鉴定[J].山东农业科学，2012，44（3）：84-87.

[5]White TJ,Bruns T,Lee S,et al.PCR protocols:a guide to methods and applications[M].San Diego:Academic Press, 1990:315-322.

[6]张学敏，杨集昆，谭琦.食用菌病虫害防治[M].北京：金盾出版社，1994.

[7]宋金俤，曲绍轩，马林.食用菌病虫识别与防治原色图谱[M].北京：中国农业出版社，2013.

[8]徐耀波.平菇和香菇代料栽培过程中的污染真菌研究[D].成都：四川农业大学，2003.

Isolation and Molecular Identification of a Pathogen in Lentinula edodes

LAN Yu-fei,YU Cheng-xiang,WANG Qing-wu,CUI Xiao
(Edible Fungi Research Institute,Taian Academy of Agricultural Sciences,Taian 271000,China)

A fungi strain,FC,was isolated from Lentinula edodes and its genome total DNA was obtained．The internal transcribed spacers(ITS)was amplified by PCR using fungi universal primers ITS1 and ITS4．Homology analysis and constructed phylogenetic tree showed that FC shared nucleotide identity of 98．27%with eight Rhizopus oryzae isolates．Combined morphological characteristics,the FC was R.oryzae.

Lentinula edodes;pathogen;internal transcribed spacers(ITS);molecular identification

S646.1

A

1003-8310（2015）06-0074-03

10．13629/j．cnki．53-1054．2015．06．019

山东省食用菌创新团队病虫害防控岗位（SDAIT-11-011-05）；国家食用菌产业体系建设专项（CARS-24）。

兰玉菲（1980-），女，博士，高级农艺师，主要从事食（药）用菌遗传多样性分析、新品种选育、病虫害防控及栽培技术开发推广研究。E-mail:lanyufei526@163．com

2015-09-12