左金方配方颗粒剂与传统汤剂诱导人胃癌细胞SGC-7901凋亡的作用比较*

周红祖，余惠旻

(1.深圳市中医院，广东深圳 518020;2.深圳大学医学院，广东深圳 518060)

左金方配方颗粒剂与传统汤剂诱导人胃癌细胞SGC-7901凋亡的作用比较*

周红祖1，余惠旻2△

(1.深圳市中医院，广东深圳 518020;2.深圳大学医学院，广东深圳 518060)

目的:比较左金方配方颗粒剂与传统汤剂对人胃癌细胞SGC-7901生长的活性抑制和凋亡诱导作用。方法:采用MTT比色法观察SGC-7901生长受抑制情况，流式细胞仪分析细胞凋亡率，Hoechst 33258染色观察细胞形态学变化。结果:左金方配方颗粒剂与传统汤剂分别作用SGC-7901细胞后均能抑制细胞活性，且与剂量、时间呈依赖关系，并可诱导SGC-7901的凋亡。结论:同一浓度的左金方配方颗粒剂与传统汤剂作用SGC-7901相同时间，左金方配方颗粒剂比传统汤剂的作用效果更为明显。

左金方颗粒剂;左金方传统汤剂;SGC-7901;凋亡

几千年来，中药都采用“饮片入药、临用煎汤”的用药方法，近年来出现了一种新型、快捷、方便的剂型即中药配方颗粒［1］。对我院2007至2014年中药配方颗粒的使用情况进行初步统计，结果显示其年均销售增长速度为44%左右，中药配方颗粒在临床应用不断扩大。学术界对中药配方颗粒的认识尚未完全统一，中药配方颗粒剂混合使用与传统汤剂理论一直是中药临床应用中的一个争议比较大的问题［2］。左金方是出自《丹溪心法》的名方，由黄连和吴茱萸按6∶1组成。本文从细胞凋亡学的角度，采用MTT比色法观察细胞的生长受抑制情况，流式细胞仪检测细胞的凋亡率，结合Hoechst染色后凋亡细胞的形态学变化，探讨左金方配方颗粒剂与传统汤剂诱导人胃癌细胞SGC-7901凋亡的作用差异，为左金方配方颗粒剂的临床应用提供新的实验依据，对指导中医临床用药具有现实意义。

1 仪器与材料

1.1 仪器

CO2培养箱(美国Shella公司);DC300型倒置荧光相差显微镜(德国Leica公司);超净工作台(比利时Esco公司);Rotofix32型离心机(德国Hettich公司);AllegraTM21R型低温离心机(美国Coulter公司);Epics XL型流式细胞仪(美国 Coulter公司); Polar star Galaxy型酶标仪(德国BMG公司)。

1.2 试药

黄连、吴茱萸均购于深圳华辉药业有限公司，由深圳市中医院中药科刘志诚主任药师鉴定为正品。黄连、吴茱萸配方颗粒剂均购自江阴天江药业有限公司(产品批号1207156、1205167，有效期至2015年6月)。MPP+、MTT、二甲基亚砜(DMSO)、碘化丙啶(PI)、RNA酶(RNase)均购自美国Sigma公司; 1640培养基、胰酶(trypsin，美国Gibico公司);胎牛血清(FBS，美国Hyclone公司);Hoechst 33258(瑞士Fluka公司)。

1.3 细胞

人胃癌细胞株SGC-7901购自中山大学医学院动物细胞中心(细胞源自美国ATCC细胞库)。

2 方法

2.1 药物制备

左金方传统汤剂冻干粉:取30 g黄连与5 g吴茱萸，加8倍蒸馏水浸泡30 min，加水煎煮3次，每次30 min，过滤、合并3次滤液冷冻干燥。左金方传统汤剂水提物冻干粉，每克干粉含生药3.98 g;左金方配方颗粒剂中，黄连、吴茱萸颗粒剂均为1 g相当于饮片6 g。1.0 mg·mL-1左金丸传统汤剂相对应的左金方配方颗粒剂浓度为0.66 mg·mL-1。

2.2 细胞培养

SGC-7901人胃腺癌细胞株在10%小牛血清RPMI1640培养液中，于 37℃条件下，在湿度为100%、含CO2为5%(体积分数)的CO2培养箱中常规培养。

2.3 实验分组

将实验分为正常对照组、左金方传统汤剂(高、中、低剂量组)及相应的左金方配方颗粒剂(高、中、低剂量组)7组。

2.4 观察指标和方法

2.4.1 MTT法测定细胞存活率 取对数生长期细胞，用 RPMI1640培养基制成细胞悬液(5× 104/mL)加入96孔板，100 μL/孔，培养24 h后给药，实验组分别加入不同浓度供试药物，分别培养12、24、36、48、60、72 h加入MTT 10 μL/孔培养4 h，吸去培养基，加入DMSO 150 μL/孔，震荡10 min。波长490 nm测吸光值(OD)。细胞抑制率=(1-实验组平均OD值/对照组平均OD值)×100%。

2.4.2 Hochest染色-荧光显微镜观察 将SGC-7901细胞(2×105/mL)接种于6孔板内的盖玻片上，各实验组按要求给予不同的处理因素后，加入新鲜配制的4%多聚甲醛(pH为7.4)，于37℃固定细胞30 min，PBS液洗2次，加5 mg/L Hochest 33258染色液染色30 min，PBS液洗后，用封片液(20 mmol/L柠檬酸，50 mmol/L磷酸氢二钠，50%甘油，pH 5.5)封片后荧光显微镜观察、摄片。

2.4.3 流式细胞仪检测 调整细胞密度为2 ×105/mL，以1.5 mL/well种入6孔板，每组6个复孔。药物作用72 h后，细胞刮刮取细胞，1000 r/min离心10 min，去上清PBS漂洗2次，沉淀中缓慢依次加入70%的冰乙醇固定，-20℃固定24 h。固定后1000 r/min离心10 min，去上清PBS漂洗2次，调整细胞浓度为1×106/mL。加RNase至终浓度100 μg/mL，37℃水浴30 min。加PI至终浓度50 μg/mL，350目尼龙网滤膜过滤去除细胞团块，4℃避光染色30 min后，上流式细胞仪检测各期细胞DNA的含量(激发波长488 nm，发射波长610 nm)。测定数据按流式细胞仪所配置的软件进行数据处理，以DNA组方图出现低于G1期DNA含量的亚G1峰大小代表凋亡细胞的多少。

2.4.4 统计学方法 采用 SPSS 1010统计软件进行统计分析，数据以均数±标准差 (±s)表示，组间比较采用单因素方差分析，P＜0.05为差异有统计学意义。

3 结果

3.1 左金方配方颗粒剂与传统汤剂对SGC-7901抑制率的影响

MTT实验结果显示，对照组细胞生长良好，经左金方配方颗粒剂与传统汤剂作用24、48、72 h后的细胞，随着给药浓度的逐渐增高，作用时间不断延长，SGC-7901细胞生长受抑制程度逐渐增强，与对照组比较差异有统计学意义(P＜0.01)。表1显示，相同浓度下左金方颗粒剂对细胞的抑制作用强于左金方传统汤剂。如0.660 mg·mL-1左金方颗粒剂作用SGC-7901细胞24、48、72 h的抑制率分别为(17.9±3.1)%、(77.4±1.9)%和(90.7±4.5)%，与相应浓度(1.0 mg·mL-1)的左金方传统汤剂比较差异有统计学意义(P＜0.01)。

表1 左金方传统汤剂与颗粒剂对SGC-7901生长抑制率的影响

3.2 左金方配方颗粒剂与传统汤剂诱导人胃癌细胞SGC-7901凋亡的作用

凋亡细胞在流式细胞仪直方图上可以出现特征性的亚二倍体峰(sub-G1 peak)，对照组自然凋亡率(1.69±1.91)%，不同浓度左金方配方颗粒剂与传统汤剂作用24、48、72 h的细胞后，随着给药浓度的逐渐增高，作用时间的不断延长，SGC-7901细胞的凋亡率逐渐增大，与对照组比较差异有统计学意义(P＜0.01)。表2显示，等效浓度的左金方颗粒剂诱导SGC-7901细胞凋亡的作用大于左金方传统汤剂，如0.1、0.5和1.0 mg·mL-1左金方传统汤剂作用于 SGC-7901细胞 48 h，细胞凋亡率分别为(11.60±1.24)%、(21.80±0.28)%、(36.40± 1.59)%，对应浓度(0.066、0.330和 0.660 mg· mL-1)的左金方配方颗粒剂分别为(17.70± 0.36)%、(30.40±1.20)%、(45.40±0.38)%，与对照组比较差异有统计学意义(P＜0.01)(图1)。流式细胞仪的检测结果说明，左金方配方颗粒剂与传统汤剂均能诱导人胃癌细胞SGC-7901的凋亡，但左金方配方颗粒剂诱导凋亡的作用明显优于左金方传统汤剂。

表2 左金方传统汤剂与颗粒剂对SGC-7901细胞凋亡的影响

图1 不同浓度左金配方颗粒剂与传统汤剂对SGC-7901细胞凋亡的影响(n=6)

3.3 左金方配方颗粒剂与传统汤剂对人胃癌细胞SGC-7901凋亡的形态学影响 ①倒置显微镜下观察结果显示，SGC-7901细胞在正常状态下贴壁生长，呈椭圆形，少数呈圆形，长至紧密时呈多角形，其折光率高、胞体大。经1.0 mg·mL-1左金方传统汤剂作用48 h后，细胞多皱缩变圆，折光率减弱，间距变大，有细胞脱落漂浮于培养液中，经0.66 mg·mL-1左金方配方颗粒剂作用48 h后，上述表现更明显;②荧光显微镜观察结果显示，经Hoehest33258荧光染色后，荧光显微镜下见空白组SGC-7901细胞膜均完整，核形态饱满，核质着色浅，密度均匀一致(见图2A);1.0 mg·mL-1左金方传统汤剂作用48 h后，细胞出现典型凋亡形态特征，即细胞膜皱缩，细胞核相对变小荧光明显增强，成高度块状(见图2C);0.66 mg·mL-1左金方配方颗粒剂作用48 h，细胞除上述特征外，可见凋亡小体数目明显多于左金方传统汤剂组(见图2B)。

图2 1.0 mg·mL-1左金丸传统汤剂与对应浓度配方颗粒剂(0.66 mg·mL-1)对SGC-7901细胞形态学影响(×200)

4 讨论

中药配方颗粒在临床的使用越来越广泛，但学术界对其认识尚未完全统一，中药传统汤剂(合煎)与中药配方颗粒剂混合使用(单煎)的等效性一直是争议的焦点问题。尽管有研究［3-4］认为，无论是配方颗粒剂与汤剂的化学成分比较，还是药效分析以及临床治疗作用的比较，均表明配方颗粒剂可与中药汤剂相媲美，有些方面疗效优于汤剂。但大多数研究［5］认为，合煎不仅仅是单味药有效成分的简单相加，并非所有的中药复方均可以配方颗粒替代，复方药物合煎与单煎的等效性还有待于严格的药理学、化学、药效学、临床试验等数据的支持。基于社会对中药配方颗粒需求量越来越大，配方颗粒使用越来越广泛的现状，积极推动中药合煎与单煎的等效性研究已成为当务之急。

本研究中MTT的结果显示，随着给药浓度的逐渐增高，作用时间的不断延长，SGC-7901细胞的生长受抑制的程度逐渐增强，相同浓度下，左金方颗粒剂对细胞的抑制作用强于左金方传统汤剂(见表1);流式细胞仪分析结果进一步表明，相同条件下，等效浓度的左金方颗粒剂诱导SGC-7901细胞凋亡的作用大于左金方传统汤剂，如0.1、0.5和1.0 mg ·mL-1左金方传统汤剂作用于SGC-7901细胞48 h，细胞凋亡率分别为(11.60±1.24)%、(21.80± 0.28)%、(36.40±1.59)%，对应浓度(0.066、0.330和0.660 mg·mL-1)的左金方配方颗粒剂分别为(17.70±0.36)%、(30.40±1.20)%、(45.40±0.38)%，与对照组比较差异有统计学意义(P＜0.01)(见表2图1);结合Hochest染色中凋亡细胞的形态学变化结果(图2)，说明左金方配方颗粒剂诱导人胃癌细胞SGC-7901凋亡的作用优于左金方传统汤剂。

以上研究为左金方配方颗粒剂的临床应用提供了新的实验依据，对指导中医临床用药具有现实意义。

［1］田红艳.浅析中药配方颗粒的优势［J］.中国中医基础医学杂志，2012，18(4):443.

［2］李长缨.中药免煎颗粒的优势与存在的问题［J］.现代医药卫生，2011，27(6):898.

［3］戴启文，张鸿程，胡娟，等.浅谈中药配方颗粒剂与汤剂的比较研究［J］.中国民族民间医药，2011，10:18-19.

［4］唐翎，李新中，雷鹏，等.黄连解毒汤传统饮片汤剂与配方颗粒汤剂药效学对比研究［J］.中药新药与临床药理，2010，21 (1):31-35.

［5］曾锐，祝勇军，俞脉文，等.小青龙汤单味浓缩配方颗粒与传统饮片临床疗效对比研究［J］.中国中医急症，2006，15 (11):1233-1234.

Function Comparison of Zuojinfang Granule and Traditional Decoction in Inducing Apoptosis of Human Gastric Cancer Cells SGC-7901

ZHOU Hong-zu1，YU Hui-min2△
(1.Shenzhen Chinese Medicine Hospital，Shenzhen 518020，China;2.School of Medicine，Shenzhen University，Shenzhen 518060，China)

Objective:To compare the cellular growth inhibition and apoptosis of human gastric carcinoma cells SGC-7901 induced by compound granule and traditional decoction of ZuoJinFang.Methods:The growth inhibition of the SGC-7901 treated by compound granule and traditional decoction of ZuoJinFang were analyzed by MTT assay.The apoptosis rates of cell were studied by flow cytometry.Hoechst 33258 staining showed the cell morphology changes.Results:After the cells treated by compound granule and traditional decoction of ZuoJinFang，the cell survival rates decreased in a dose-timedependent manner.Conclusion:Compound granule and traditional decoction of ZuoJinFang significantly inhibited the growth of SGC-7901 and induced the cell apoptosis.While the effect of compound granule was stronger than and traditional decoction of ZuoJinFang under the same conditions.

Compound granule of ZuoJinFang;Traditional decoction of ZuoJinFang;SGC-7901;Apoptosis

R285.5

:B

:1006-3250(2015)07-0833-04

2015-02-22

广东省中医药局项目(20141253);深圳市战略新兴产业发展专项(JCYJ20130326112248968)

周红祖(1971-)，女，新疆人，副主任药师，医学学士，从事中药肿瘤药理学及中药学基础研究。

△通讯作者:余惠旻(1972-)，男，新疆人，医学博士，从事中药及其复方抗肿瘤的临床与研究，Tel:0755-86671902，E-mail:yuhuimin@szu.edu.cn。