眼针运动疗法对脑缺血再灌注大鼠脑缺血半暗带区VEGF蛋白及VEGFmRNA表达的影响*

邵 妍，王鹏琴，王树东，李超华

(1．辽宁中医药大学，沈阳 110032;2．辽宁中医药大学附属医院，沈阳 110033)

眼针运动疗法对脑缺血再灌注大鼠脑缺血半暗带区VEGF蛋白及VEGFmRNA表达的影响*

邵 妍1，2，王鹏琴2，王树东1，李超华1

(1．辽宁中医药大学，沈阳 110032;2．辽宁中医药大学附属医院，沈阳 110033)

目的:观察眼针运动疗法对脑缺血再灌注(MCAO)模型大鼠大脑缺血半暗带区域脑组织内VEGF、VEGFR1、VEGFR2表达的影响。方法:采用随机数字表法将SD大鼠按随机数字表法分为空白对照组、假手术组、模型复制组。对模型复制组大鼠采用线栓法进行脑缺血再灌注模型复制，再将模型复制组按随机数字表法分为模型对照组、眼针组、眼针加运动组，分别进行眼针、眼针运动疗法干预治疗，采用RT-PCR及western-blot法对各组大鼠脑组织中VEGF、VEGFR1/2基因及蛋白表达水平进行检测。结果:与空白对照组比较，模型对照组、眼针组及眼针运动疗法组大鼠脑缺血半暗带区域组织中VEGF、VEGFR1、VEGFR2 mRNA及蛋白表达水平显著升高;与模型对照组比较，眼针组及眼针运动疗法组大鼠脑缺血半暗带组织中VEGF、VEGFR1、VEGFR2 mRNA及蛋白表达水平显著升高;眼针运动疗法组大鼠脑组织中VEGF、VEGFR1、VEGFR2 mRNA及蛋白表达水平高于眼针组。结论:眼针运动疗法能够促进脑缺血再灌注损伤后脑内缺血半暗带区域内VEGF、VEGFR1、VEGFR2 mRNA及蛋白的表达，从而促进半暗带组织中血管的新生，加快侧枝循环的建立，实现其脑保护作用。

眼针疗法;眼针运动疗法;脑缺血再灌注;血管内皮生长因子;侧枝循环

脑卒中是严重威胁人类健康的疾病，占脑血管病发病率80%左右，其病死率、复发率、致残率在我国死亡率中仅次于恶性肿瘤，严重危害人类健康［1-2］。眼针运动疗法是我的导师王鹏琴教授在眼针疗法基础上结合多年临床经验创建，即中风患者在眼针针刺同时进行康复训练。目前，眼针运动疗法治疗脑卒中在我院康复中心应用已3年余，治疗脑卒中患者500多名，该方法能明显改善中风后遗症患者的临床症状且疗效显著，明显提高其生活质量。近年来，眼针在治疗缺血性脑血管病方面收到了一定的疗效，但其机理尚不明确［3］，而关于眼针运动疗法的实验研究国内尚未有相关报道。

本研究以眼针运动疗法为干预因素，对脑缺血再灌注模型大鼠进行治疗，以观察VEGF、VEGFR1、VEGFR2表达水平的变化，为眼针运动疗法治疗缺血性脑卒中提供实验依据。

1 材料与方法

1．1 材料与试剂

健康SPF级SD大鼠70只，雌雄不限，体质量(280±20)g，由辽宁长生生物技术有限公司提供(许可证号SCXK(辽)2010-0001)。自由饮水，标准颗粒饲料喂养，室内温度18～22℃，相对湿度45%。

总 RNA提取试剂、RT-PCR试剂盒、DNA marker购自宝生物工程(大连)有限公司，VEGF及VEGFR1/2引物由北京三博远志生物科技有限公司代为合成。亲和纯化兔抗大鼠VEGF及VEGFR1/2多克隆抗体购自 abcam公司，羊抗兔二抗、蛋白marker购自北京全式金生物技术有限公司。

1．2 实验方法

①实验分组采用随机数字法将70只SD大鼠随机分为空白对照组(10只)、假手术组(10只)、模型复制组(50只)3组。对模型复制组大鼠采用线栓法进行脑缺血再灌注模型复制，再将模型复制成功的40只大鼠(模型复制50只，失败9只，模型评价1只)按随机数字表法分为2组，分别为模型对照组(14只)、眼针组(13只)、眼针运动疗法组(13只);②模型制备与评价参照马贤德等人的研究方法［4］，对模型复制组50只大鼠采用改良线栓法复制大鼠大脑中动脉缺血再灌注损伤模型。模型的评价参照ZeaLonga 5分制评分标准［2］:0分:无症状;1分:不能完全伸展对侧前爪;2分:向对侧转圈;3分:向对侧倾倒;4分:不能自发行走，意识丧失。评分1～3分者纳入实验组，未达标准者排除;③ 眼针取穴及针刺手法:取13 mm毫针，眼针组于大鼠眶周2 mm处针刺，定位参照人体取穴方法［3-4］，取肝区、上焦区、下焦区、肾区(见图1)。针刺手法:从眼眶边缘1 mm部位平刺，左眼按照顺时针方向(右侧按逆时针方向)，从该穴区起始定位线向终止定位线进针，进行平刺操作，刺入真皮达到皮下组织，进针3 mm，到终止定位线为止。留针20 min，留针10 min时用刮柄进行刮针1次，刮针5下。治疗时机:眼针组于脑缺血再灌注后1 h即开始针刺，每隔8 h进行1次，缺血72 h后进行样本采集，采集样本前30 min进行末次针刺，共计9次针刺干预。空白对照组、假手术组和模型对照组不做针刺干预;④ 眼针运动疗法:眼针运动疗法组大鼠在眼针治疗同时在跑步机上进行训练，时间为30 min，跑步机速度为5 m/min，坡度为0度，每日2次;⑤ 指标测定模型复制后2 h，根据ZeaLonga 5分制评分标准对各组大鼠进行行为学体征评分并分析。模型复制2 h后，于空白对照组、假手术组和模型复制组大鼠中各随机抽取1只，断髓处死后取出整个脑组织，采用TTC染色方法观察脑缺血坏死灶发生情况。各组大鼠脑缺血半暗带区域组织VEGF、VEGFR1、VEGFR2蛋白表达(Western blot法):末次针刺后10 min，各组大鼠随机抽取8只，以10%水合氯醛腹腔注射麻醉大鼠后，断头取出整个脑组织去掉小脑，观察大脑软化灶范围，用手术刀柄钝性剥离去除液化的脑组织，沿梗死灶边缘切取1 mm宽的半暗带脑组织(空白对照组和假手术组切取颞叶大脑皮层组织)，按组织净重与裂解液1∶10的比例加入蛋白提取试剂，并用玻璃匀浆器在冰上进行匀浆，匀浆后静置于冰上20 min，10000 r/min进行离心，离心15 min分离上清液即为总蛋白备用。采用考马斯亮蓝法对各组总蛋白进行蛋白定量，每孔上样20 ug总蛋白进行电泳，半干转印法将蛋白转至PVDF膜，一抗(1∶200) 4℃孵育过夜，二抗(1∶2000)室温孵育1 h，ECL发光，胶片曝光，扫描胶片，并于凝胶成像分析系统中测定目的蛋白条带和内参蛋白条带灰度值，以目的条带灰度值/内参条带灰度值作为该例样本的蛋白表达水平进行统计分析。各组大鼠脑缺血半暗带区域组织VEGF、VEGFR1、VEGFR2 mRNA表达(RTPCR法):采用RT-PCR方法对各组大鼠脑缺血半暗带组织VEGF、VEGFR1/2 mRNA表达水平进行检测。

VEGF、VEGFR1、VEGFR2 mRNA引物序列如下:扩增产物经琼脂糖凝胶电泳后，于凝胶成像分析系统采集图像并测定目的基因及内参基因条带的积分光密度值，以目的基因积分光密度值/内参基因积分光密度值比值作为统计数据进行统计分析。

表1 引物序列表

1．3 统计学方法

采用SPSS 10．0软件进行统计分析，实验数据以均数±标准差(±s)表示，组间比较采用单因素方差分析，P＜0．05为差异有统计学意义。

2 结果

2．1 模型评价结果

与空白对照组比较，模型复制组大鼠行为学评分有统计学意义(P＜0．01);与假手术组比较，模型复制组大鼠行为学评分有统计学意义(P＜0．01)。

表1图1显示，全脑组织TTC染色结果显示，模型复制组大鼠出现明显梗死灶，而空白对照组和假手术组未见梗死灶出现。

2．2 各组大鼠脑缺血半暗带区域组织VEGF、VEGFR1/2蛋白表达结果

表2、图2～4显示，VEGF、VEGFR1、VEGFR2蛋白表达结果显示，与空白对照组比较，模型对照组、眼针组及眼针加运动组大鼠脑缺血半暗带区域组织中VEGF、VEGFR1、VEGFR2蛋白表达水平显著升高(P＜0．01)，差异有统计学意义;与模型对照组比较，眼针组及眼针加运动组大鼠脑缺血半暗带组织中VEGF、VEGFR1、VEGFR2蛋白表达水平显著升高(P＜0．05或0．01)，差异有统计学意义;眼针加运动组大鼠脑组织中VEGF、VEGFR1、VEGFR2蛋白表达水平高于眼针组(P＜0．05)

表2 各组大鼠行为学评分(±s)

表2 各组大鼠行为学评分(±s)

注:与空白对照组比较:*P＜0．01;与假手术组比较:#P＜0．01

组 别 例数 行为学评分空白对照组10 0．000±0．000假 手 术 组 10 0．100±0．316模型复制组 41 2．244±0．624*#

图1 各组大鼠脑组织TTC染色

表3 各组大鼠脑缺血半暗带组织中VEGF、VEGFR1、VEGFR2蛋白表达水平(±s)

表3 各组大鼠脑缺血半暗带组织中VEGF、VEGFR1、VEGFR2蛋白表达水平(±s)

注:与空白对照组比较:*P＜0．01;与模型对照组比较:#P＜0．05，##P＜0．01;与眼针组比较:△P＜0．05

组蛋白表达水平(灰度值比值) VEGF VEGFR1 VEGFR2空白对照组别例数6 0．191±0．016 0．209±0．014 0．257±0．020假 手 术 组 6 0．180±0．021 0．217±0．014 0．252±0．018模型 对 照 组 6 0．308±0．026* 0．348±0．022* 0．377±0．024*眼 针 组 6 0．336±0．014*# 0．370±0．020*# 0．412±0．020*##眼针加运动组 6 0．365±0．018*##△0．391±0．014*##△ 0．438±0．022*##△

图2 各组大鼠脑缺血半暗带组织中VEGF蛋白表达注:1．空白对照组;2．假手术组;3．模型对照组; 4．眼针组;5．眼针加运动组

图3 各组大鼠脑缺血半暗带组织中VEGFR1蛋白表达注:1．空白对照组;2．假手术组;3．模型对照组; 4．眼针组;5．眼针加运动组

2．4 各组大鼠脑缺血半暗带区域组织VEGF、VEGFR1/2 mRNA表达结果

表3、图5～7显示，VEGF、VEGFR1、VEGFR2mRNA表达结果显示，与空白对照组比较，模型对照组、眼针组及眼针加运动组大鼠脑缺血半暗带区域组织中VEGF、VEGFR1、VEGFR2 mRNA表达水平显著升高(P＜0．01)，有统计学意义;与模型对照组比较，眼针组及眼针加运动组大鼠脑缺血半暗带组织中VEGF、VEGFR1、VEGFR2 mRNA表达水平显著升高(P＜0．01)，有统计学意义;眼针加运动组大鼠脑组织中VEGF、VEGFR1、VEGFR2 mRNA表达水平高于眼针组(P＜0．05)。

图4 各组大鼠脑缺血半暗带组织中VEGFR2蛋白表达注:1．空白对照组;2．假手术组;3．模型对照组; 4．眼针组;5．眼针加运动组

表4 各组大鼠脑缺血半暗带组织中VEGF、VEGFR1、VEGFR2 mRNA表达水平(±s)

表4 各组大鼠脑缺血半暗带组织中VEGF、VEGFR1、VEGFR2 mRNA表达水平(±s)

注:与空白对照组比较:*P＜0．01;与模型对照组比较:#P＜0．01;与眼针组比较:△P＜0．05

组 别 例数蛋白表达水平(积分光密度比值) VEGF mRNA VEGFR1 mRNA VEGFR2 mRNA空白 对照 组6 0．195±0．029 0．220±0．030 0．250±0．029假 手 术 组 6 0．192±0．033 0．228±0．026 0．252±0．025模型 对 照 组 6 0．321±0．029* 0．358±0．038* 0．425±0．055*眼 针 组 6 0．401±0．027*# 0．459±0．050*# 0．509±0．066*#眼针加运动组 6 0．442±0．033*#△ 0．515±0．056*#△ 0．567±0．053*#△

图5 各组大鼠脑缺血半暗带组织中VEGF mRNA表达注:M．marker;1．空白对照组;2．假手术组; 3．模型对照组;4．眼针组;5．眼针加运动组

图6 各组大鼠脑缺血半暗带组织中VEGFR1 mRNA表达注:M．marker;1．空白对照组;2．假手术组;3．模型对照组; 4．眼针组;5．眼针加运动组

3 讨论

眼针疗法［5-6］是彭静山教授根据中医理论和临床探索创立的，经过40余年的临床应用及不断发展，具有完备的系统理论的一种特色微针疗法。《灵枢·邪气脏腑病形》:“十二经脉，三百六十五络，其血气皆上于面而走空窍，其精阳气上走于目而为晴。”王肯堂《证治准绳》所载华佗论述:“目形类丸，瞳神居中而前，如日月之丽东南而晚西北也……故凡病发，则有形色丝络显现，而可验内之脏腑受病也”，均为眼针的理论根据。我的导师课题组既往通过国家科技部973课题研究，创新提出“眼针八区十三穴络脑通脏腑”的眼针核心理论。

康复训练对于脑卒中患者的治疗效果还不理想，因此探索一个适合我国国情的康复治疗体系，探寻康复治疗脑卒中的有效方法是非常必要和急迫的［7］。近年来研究表明，针刺和康复训练［8-9］能够改善脑卒中后认知障碍，提高运动功能和日常生活活动能力。

脑血管侧支循环分三级:1级侧支循环是前交通动脉(AComA)和后交通动脉(PComA);2级侧支循环是眼动脉和软脑膜侧支;3级侧支循环是新生血管，是目前研究热点。如何有效地打开二级侧支循环，促进三级侧支代偿即新生血管的发生，良好的侧支循环可减少梗死灶容积，改善预后，减低复发风险，是目前临床治疗的研究方向［10-11］。眼针运动疗法治疗脑卒中临床疗效显著，其治疗机制可能是通过上调MCAO模型大鼠脑组织中VEGF、VEGFR1、VEGFR2 mRNA及蛋白的表达水平，促进半暗带组织中血管的新生，加快侧支循环的建立，实现脑保护作用。

血管内皮生长因子 (vascular endothelial growth factor，VEGF)是由Ferrara等于1989年在牛垂体滤泡星状胶质细胞体外培养液中纯化而来，能够参与血管新生，在目前发现的调节因子中，VEGF内皮细胞特异性最高，促血管构建作用最强［12］。正常机体中，VEGF表达水平较低，而在病理条件下，VEGF无论是基因水平还是蛋白水平，均表现为过表达［13］。也有研究表明［14-15］，VEGF基因启动子区包含HIF-1的反应元件，缺血缺氧刺激可强效诱发VEGF及其受体的表达，也有人认为缺氧因素可激活 c-Src，而 c-Src能偶上调 VEGF的表达［16］。VEGF能够增加血管的通透性，促进血管外基质沉淀，从而促进血管新生［17］。

本研究在模型复制后，分别应用眼针疗法和眼针运动疗法治疗，各组大鼠脑组织检测结果显示，脑缺血再灌注发生后，脑组织缺血半暗带区域内VEGF、VEGFR1、VEGFR2 mRNA及蛋白表达水平显著升高。眼针和眼针运动疗法组治疗后，三者表达水平进一步上调，眼针运动组大鼠表达上调尤为明显。

综上所述，眼针疗法及眼针运动疗法可以增加脑缺血再灌注损伤引起脑内缺血半暗带血管内皮生长因子及其受体表达增高，从而促进半暗带组织中血管的新生，通过缺血半暗带区域脑组织VEGF/ VEGFR信号传导通路，促进微血管的新生，从而加速侧枝循环建立，改善脑部缺血，从而发挥对脑细胞损伤的保护作用 为临床进一步应用眼针运动疗法治疗缺血性脑血管疾病奠定理论基础。

图7 各组大鼠脑缺血半暗带组织中VEGFR2 mRNA表达注:M．marker;1．空白对照组;2．假手术组;3．模型对照组; 4．眼针组;5．眼针加运动组

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Eye acupuncture with exercise to concentrate on cerebral ischemia and ischemia rats half dark stripe effect of VEGF protein expression and VEGFmRNA

SHAO Yan1，2，WANG Peng-qin2，WANG Shu-dong1，LI Chao-hua1

(1．Liaoning，Liaoning university of Traditional Chinese medicine，Shenyang 110032，China; 2．Liaoning university Hospital of Traditional Chinese medicine，Shenyang 110033，China)

Objective:to observe the needle eye exercise therapy on cerebral ischemia reperfusion(MCAO)model in the rat brain ischemia half dark area within the brain tissue VEGF，VEGFR1，VEGFR2 expression．Methods:using random number method，the SD rats were randomly divided into blank control group，control group，the model copy group．Copy the model group rats by using line switch on cerebral ischemia reperfusion model replication，and then copy model group were randomly divided into model control group，the eye，eye needle plus exercise group．Respectively，eye for eye needle exercise therapy intervention treatment，by the method of Rt-pcr and western blot-of VEGF，groups of rats had VEGFR1/2 for testing the level of gene and protein expression．Results:compared with blank control group，model control group and eye，eye needle group exercise therapy in ischemia rats half dark with VEGF in regional organizations，VEGFR1，VEGFR2 mRNA and protein expression level increased significantly;Compared with model control group，group and eye eye needle exercise therapy group of VEGF in ischemia rats half dark band organization，VEGFR1，VEGFR2 mRNA and protein expression level increased significantly;Needle eye exercise therapy in VEGF group rats had，VEGFR1，VEGFR2 mRNA and protein expression level is higher than eye needle group．Conclusion:pay close attention to again needle eye exercise therapy can promote brain ischemia injury after brain ischemia within half dark belt area of VEGF，VEGFR1，VEGFR2 mRNA and protein expression，thus facilitating half dark with tissue，new blood vessels to speed up the establishment of collateral circulation，achieve the cerebral protective effect．

eye acupuncture;eye acupuncture with exercise therapy;Cerebral ischemia reperfusion;Vascular endothelial growth factor;Collateral circulation

R246．82

B

1006-3250(2015)04-0445-04

2015-01-11