针刀干预对膝骨关节炎兔软骨细胞整合素β1表达的长期影响*

张丽萍，郭长青

(北京中医药大学，北京 100029)

针刀干预对膝骨关节炎兔软骨细胞整合素β1表达的长期影响*

张丽萍，郭长青△

(北京中医药大学，北京 100029)

目的:探讨针刀对KOA的长期作用。方法:按随机数字表法将48只兔分为空白组、模型组、针刀组、电针组各12只，后3组用伸直位固定制动法造模，治疗后取材检测软骨整合素β1mRNA、蛋白。结果:模型组整合素mRNA水平降低，较空白组比较差异有统计学意义;针刀组整合素mRNA水平上升，较空白组比较差异无统计学意义;电针组整合素蛋白水平上升，较空白组差异显著。结论:针刀可上调整合素β1基因和蛋白水平，长期观察发现其含量接近正常，即针刀的长期疗效是显著的。

膝骨关节炎;针刀;整合素β1;长期影响

膝骨关节炎(knee Osteoarthritis，KOA)是一种临床常见的慢性关节疾病，其主要病变是膝关节软骨退行性改变和继发性骨质增生，表现为关节疼痛、畸形和功能障碍［1］。膝骨关节炎的发病机制目前尚未完全明确，部分学者认为其发病途径之一有可能是膝关节周围软组织损伤引起膝关节力学平衡失调后，力学信号刺激软骨细胞膜上的信号传导因子整合素，启动软骨细胞内一系列的生化反应，调控细胞内胶原、基质金属蛋白酶的基因表达，最终造成软骨基质的病变。因此，整合素在软骨细胞内的基因与蛋白的表达和软骨基质的损伤与修复有着密切的关系。针刀松解法在治疗经筋疾病方面已经形成了一套比较完整、规范的操作技术，且临床上我们应用针刀松解法治疗膝骨关节炎取得了良好的疗效。前期的动物实验已经初步研究了针刀通过松解膝关节周围软组织达到修复软骨的短期作用机制。本实验以膝骨关节炎兔为研究对象，通过针刀松解法治疗后，观察膝关节软骨中整合素β1基因及蛋白表达水平的长期变化，研究针刀松解法对膝骨关节炎兔软骨细胞内整合素β1基因、蛋白表达的长期影响，探讨针刀松解法治疗膝骨关节炎的长期疗效。

1 材料与方法

1.1 动物及分组

6月龄新西兰家兔48只，体质量(2.25±0.25) kg，由北京市金牧阳实验动物养殖有限责任公司提供，在北京军区总医院骨科研究所动物实验室喂养。按随机数字表将家兔分为空白组、模型组、电针组、针刀组各12只，除空白组外其余3组均参加造模。

1.2 主要设备和试剂

直径0.40 mm、长40 mm的汉章牌一次性针刀，直径0.25 mm、长25 mm的环球牌一次性无菌针灸针。LH202H型HANS穴位神经刺激仪。Real-Time PCR仪(型号IQ5，BIO-RAD)，美国。超微量核酸蛋白测定仪(型号ND2000C，Thermo)，美国。动物组织总RNA提取试剂盒、Quant cDNA第一链合成试剂盒、SuperReal PreMix(SYBR Green)PCR试剂盒，天根生化科技(北京)有限公司。一抗Integrin-β1为鼠单抗(货号MAB1981，美国MILLIPORE公司)，二抗山羊抗小鼠IgG(H+L)，HRP(货号S001，北京天德悦生物科技有限责任公司)。

1.3 膝骨关节炎模型复制

采用改良后Videman法［2］即左后肢伸直位固定制动法:除空白组外，另3组造模块动物于造模前禁食10～16 h，以3%戊巴比妥钠溶液按30 mg/kg剂量耳缘静脉注射麻醉，剪去左后肢踝关节以上兔毛，牵拉使其处于完全伸直位，树脂绷带经65℃ ～85℃热水浸泡软化后，从腹股沟到趾头固定(膝关节伸直180°，踝关节背屈60°)，留出足趾观察血供，树脂外以石膏固定，继用医用纱布包裹，加以制动并保持其透气性，以防止兔撕咬，共制动6周［3］。如足趾有坏死、发黑、浮肿等情况出现，应立刻拆除石膏、树脂，待肿胀消退后再重新固定。若树脂松动或脱落应及时重新固定。在整个造模过程中，若出现足底溃烂、咬伤、骨折、皮肤感染、腹泻等情况均予以剔除。

1.4 干预方法

空白组不做任何处理;模型组造模后不做干预治疗;电针组造模后1周，以韩氏穴位神经刺激仪进行电针刺激治疗，分别连接内膝眼和外膝眼、阳陵泉和阴陵泉。波形疏密波，频率2/100 Hz，强度3 mA，每次20 min，以动物肢体微颤且无嘶叫为度。隔天治疗1次，1周治疗3次，共治疗3周。

针刀组造模后1周，在兔膝关节针刀进针部位，以龙胆紫定位，常规备皮、消毒，然后刺入针刀，出针并按压片刻止血。每周1次，共3次，共治疗3周。各进针点具体操作如下:①内、外侧副韧带进针点操作:针刀于韧带中点前缘进针，刀口线与韧带方向平行，刀体与皮肤切面垂直刺入，向韧带起、止点方向分别松解，出刀并加压片刻;②髌韧带进针点操作:刀口线与髌韧带纵轴平行，刀体和髌韧带皮肤切面垂直。快速剌入达髌韧带下，由上而下松解，出刀并加压片刻。

1.5 取材

各组动物在治疗结束3周后以空气栓塞法处死进行取材。超净工作台上以锐利刀片于股骨外侧髁快速切取拇指指甲大小全新鲜软骨组织，液氮冷冻，－70℃冰箱保存备用。

1.6 指标检测

1．6．1 RT-PCR法检测软骨整合素β1基因表达 表1显示，取10～20 mg组织，使用“动物组织RNA提取试剂盒”进行提取。经检测所有标本RNA浓度为20～50 ng/ul，且OD260/OD280介于1.9～2.1之间。对RNA使用反转录试剂盒进行反转录反应使其转换成cDNA，反应体系为20 μL，其中RNA模板5 μL，10×RT buffer 2 μL，Oligo dT引物2 μL， dNTP Mixture 2 μL， QuantReverse Transcriptase 1 μL，RNaese-free ddH2O 8 μL;反应程序为37℃60 min。反应体系为20 μL，其中cDNA模板0.4 μL，上下游引物(浓度为10 μM)各0.3 μL，2×SuperReal PreMix 10 μL，RNaese-free ddH2O 9 μL。反应程序为95℃变性15 min后，95℃ 10 s，60℃ 32 s共45个循环［4］。用相对定量法分析结果，用各个样本的目的基因的Ct值-各个样本的内参基因(beta actin)的Ct值，得到ΔCt;用处理组的ΔCt-空白组ΔCt的均值，得到ΔΔCt;各组与空白组比较其待测基因 mRNA的相对表达水平 =2－ΔΔCt。兔Integrin-β1、GAPDH引物，以GAPDH为内参照，各引物序列和产物大小如下。

表1 引物序列和产物值

1．6．2 Western blot法检测软骨整合素β1蛋白表达 预冷RIPA蛋白抽提试剂加入蛋白酶抑制剂。在蛋白抽提开始前加入0.1 M PMSF母液，PMSF终浓度1 mM。将兔膝关节软骨组织从液氮中取出，称取组织质量:裂解液体积=1∶9比例加入裂解液，用眼科剪剪碎组织块，Fluka电动组织匀浆器15000 rpm转速进行匀浆，每次10 s，间隔10 s，进行3次匀浆。匀浆时EP管需要浸入冰水混合物中进行降温。匀浆完成后在冰上孵育20 min，4℃离心，13000 rpm，20 min。离心完成后取上清，分装保存，用BCA法蛋白定量法测定蛋白含量后，以RIPA调整蛋白浓度，加入5×还原样品缓冲液后样品终浓度为4 mg/ml，煮沸变性5 min。

1．6．3 目的蛋白WB检测 根据目的蛋白的分子量，配制12%的分离胶，浓缩胶浓度为5%，待检测蛋白样品上样量20 ug/孔，电泳条件为浓缩胶恒压90V，约20 min，分离胶恒压160 V，通过预染蛋白marker来确定电泳停止时间。大分子量蛋白integrinβ-1300 mA恒流，0.45 um孔径NC膜，转膜时间2 h，转膜完成后丽春红染色试剂对膜进行染色，将膜完全浸没在3%BSA-TBST中室温轻摇30 min。用3%BSA-TBST按比例1∶500稀释integrin β1一抗，室温孵育10 min，放4℃过夜。第2天从4℃拿出膜，在室温孵育30 min，TBST洗膜5次，每次3 min。用5%脱脂奶粉-TBST稀释二抗，山羊抗鼠IgG(H+L)HRP，1∶10000室温轻摇40 min;TBST洗膜6次，每次3 min。

1．6．4 内参蛋白WB检测 Stripping Buffer洗膜，37℃洗膜30 min，去离子水洗膜3次，TBST洗膜3次，每次3 min，将膜完全浸没3%BSA-TBST中室温轻摇30 min;加GAPDH鼠单抗，用5%奶粉稀释抗体，1∶40000稀释，室温孵育40 min;TBST洗膜5次，每次3min。用5%脱脂奶粉-TBST稀释二抗，山羊抗小鼠IgG(H+L)HRP，1∶10000，室温轻摇40 min。TBST洗膜5次，每次3min。

ECL加到膜上后反应3～5 min，胶片曝光10 s ～5 min(曝光时间随不同光强度而调整)，显影2 min，定影。

1.7 统计学方法

采用SPSS 17.0统计软件进行统计分析，所得数据以均数±标准差(±s)表示，采用单因素方差分析。先行正态性检验，发现结果满足正态分布，继而采用方差齐性检验，2组间比较采用LSD检验，P ＜0.05为差异有统计学意义，P＜0.01为统计学差异显著。

2 结果

2.1 针刀干预对 KOA兔软骨中 Integrinβ1 mRNA表达的影响

表2显示，兔膝关节软骨中Integrinβ1 mRNA表达水平，模型组较空白组明显下降，差异有统计学意义(P＜0.01);与模型组比较，针刀组与电针组有所上升，与之比较差异有统计学意义(P＜0.01);针刀组与空白组比较，含量基本一致，差异无统计学意义(P＞0.05);电针组与空白组比较含量还是较低，差异有统计学意义(P＜0.01);针刀组比电针组比较含量相对较多，差异有统计学意义(P＜0.01)。

表2 各组兔软骨Integrinβ1 mRNA表达水平比较(±s)

表2 各组兔软骨Integrinβ1 mRNA表达水平比较(±s)

注:与模型组比较:▲▲P＜0.01;与空白组比较:☆☆P＜0.01

组别 样本数 Ct值空白组 9 1.08±0.18▲▲模型组 10 0.56±0.16☆☆电针组 9 0.76±0.12▲▲☆☆针刀组 10 0.95±0.13▲▲

2.2 针刀松解法对KOA兔软骨中Integrinβ1蛋白表达的影响

表3图1显示，造模后兔软骨中Integrinβ1蛋白表达显著下降，模型组与空白组比较差异有统计学意义(P＜0.01);针刀及电针干预后，Integrinβ1蛋白表达水平有所回升，针刀组与模型组比较差异有统计学意义(P＜0.01);电针组与模型组比较，含量有所提高，差异有统计学意义(P＜0.05);与空白组比较，针刀组含量与之基本相等，差异无统计学意义(P＞0.05);电针组含量上升，但与空白组比较差异有统计学意义(P＜0.01);针刀组与电针组虽都有上升，但电针组明显少于针刀组，两者比较差异有统计学意义(P＜0.01)。

表3 各组兔软骨Integrinβ1蛋白表达水平比较(±s)

表3 各组兔软骨Integrinβ1蛋白表达水平比较(±s)

注:与模型组比较:▲▲P＜0.01，▲P＜0.05;与空白组比较:☆☆P ＜0.01

组 别 样本数 Integrinβ1蛋白相对表达量空白组 6 2.98±0.53▲▲模型组 6 0.83±0.33☆☆电针组 6 1.50±0.60▲☆☆针刀组 6 2.69±0.44▲▲

图1 各组兔软骨Integrinβ1蛋白Western blot条带图

3 讨论

整合素是黏附分子中的一类，由a、β亚单位经非共价键连接而成的异二聚体跨膜糖蛋白［5］。在脊椎动物中已发现18种不同的α亚单位和8种β亚单位，它们按不同组合构成至少24种整合素［6］。软骨细胞膜上主要表达整合素β1，以整合素α1β1型、整合素α3β1型、整合素α5β1型多见［7］。其中，α10β1则是稳定软骨细胞表型的最主要分子［8-9］。研究已经发现，幼年期β1整合素的缺乏会导致严重的软骨发育不全和关节的多种异常［10］。软骨细胞感受外在的应力刺激并将力学信号转化为细胞内化学信号，进而影响细胞各种生理活动，改变细胞外基质成分使软骨适应外在的负荷变化，这一过程称之为力学信号传导。整合素介导的信号传导途径按传递方向可分为外向信号传导和内向信号传导［11］。其中，内向信号传导能影响胞内多种靶基因表达，从而调节细胞增殖、凋亡、黏附、迁移等生理过程，是细胞维持正常生理代谢的关键所在［12］。整合素是细胞表面应力受体之一，其通过细胞外基质(extracellular matrix，ECM)/整合素/细胞骨架蛋白形成的黏着斑完成力化学传导来调控软骨细胞的增殖和分化功能。整合素是软骨细胞表面感受力学刺激的受体，能将所感应的力学刺激信号通过细胞表面特殊的分子通道传递至胞内不同结构部件上，实现力化学转换，调节细胞的生理功能［13］。越来越多的研究表明，整合素对于力学信号的传入转化有着重要作用，但是整合素自身在力学刺激下的变化及其机制的研究目前尚未明确，还有待进一步实验研究。

本实验采取膝关节伸直位固定制动法，其关节力学变化使关节面负重减小，给关节软骨所施加的力量相对升高，生物力学方面的应力平衡失调，膝关节周围软组织的积累性损伤，导致膝关节动态力学平衡失调，关节周围的韧带、肌肉等软组织长时间牵拉无法收缩而受损，从而破坏膝关节内部的力学平衡，使正常负重的力线发生变化，关节软骨面有效负重面积减少，单位面积内的骨小梁压力增高，引起骨质增生或微小骨折，导致膝关节发生一系列的退行性改变［14］。

通过前期实验研究发现，家兔膝关节损伤的病理改变及修复过程与人极其相似，具有良好的可重复性及相似性。造模后，兔膝关节软骨中，整合素β1mRNA表达水平明显下降，说明模型制动造成膝关节力学平衡失调，力学信号发生转变，传导到细胞膜调控了整合素的基因表达。治疗之后，针刀组与空白组比较，基因表达上升，其含量基本一致;电针组与空白组比较，其基因含量也有所上升，说明针刀松解法和电针治疗对整合素β1基因表达均可产生长期的影响。但从实验统计结果可以看出，针刀松解法的长期调节作用要优于电针治疗。在整合素β1蛋白表达方面，针刀组与空白组之间含量基本相同，说明针刀松解法通过对软组织的松解，调节膝关节力学平衡，而调整整合素β1蛋白的表达水平;电针组与空白组比较，蛋白含量也有所上升，说明电针对整合素蛋白表达也有一定的影响，但针刀组长期提高整合素蛋白表达的能力高于电针组。以上实验结果表明，膝关节的制动可以使处于静压力状态下的膝关节软骨细胞发生严重的病理变化，这种应力抑制了整合素β1基因和蛋白的表达，使软骨发生相应的细胞凋亡，针刀通过对膝关节周围韧带等软组织的松解，调整了关节内部压力，使得关节内部的力学信号发生转变，提高整合素β1基因和蛋白的表达水平。从针刀的影响来看，整合素介导的信号传导通路被启动后，在较长一段时期内，其基因和蛋白表达接近于正常组水平，且针刀松解法调整水平明显优于电针组，说明针刀的长期疗效是值得肯定的。

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Long-range Influences of Acupotomy Therapy on Integrinβ1 of Cartilage in Rabbits with Knee Osteoarthritis

ZHANG Li-ping，GUO Chang-qing△
(College of Acupuncture and Moxibustion，Beijing University of Traditional Chinese Medicine，Beijing 100029，China)

Objective To explore the long-range mechanism of needle knife lysis on knee osteoarthritis．Methods:Sixmonth-old New Zealand rabbits were randomly divided into normal control group，model group，acupotomy group，and electro-acupuncture(EA)group．KOA model was established by videman，After modeling，acupotomy group and electroacupuncture group were treated for three weeks，once every week in acupotomy group，and three times in electroacupuncture group．After the treatment，continued to normal breeding three weeks，then testted rabbits’behavior with knee level assessment method;Expression of apoptosis genes integrinβ1 mRNA，was conducted by Real-time PCR test，and expression of apoptosis proteins integrinβ1，was conducted by Western blot test．Results The results of Real-time PCR tests :after modeling，Integrin β1 mRNA expression levels in the rabbit knee cartilage extremely reduced;compared with normal control group showed an extreme difference．After acupotomology intervention and continued to normal breeding three weeks，compared with model group，Integrin β1 mRNA expression levels rose．There was no significant difference between the normal control group and the acupotomology group．Compared with normal control group，Integrin β1 mRNA expression level rose in electro-acupuncture，showing an extreme difference．The results of western blot tests:after modeling，integrinβ1 protein levels in the rabbit knee cartilage reduced abnormally，compared with normal control group showed a significant difference．Acupotomology intervention raised the integrin β1 protein expression levels，and electricity for this regulation raised the integrin β1 protein expression levels．Conclusion:Acupotomology not only can adjust the mechanical signals stimulate cartilage cells and raise the gene and protein expression levels of integrinβ1，but also can improve cartilage matrix．In the long-term observation its content closed to normal．This illustrates the long-term efficacy of Acupotomology is positive．

Osteoarthritis of the knee;Acupotomy;Integrinβ1;Long-range Influences

R244．5

B

1006-3250(2015)10-1291-03

2015-03-17

国家自然科学基金资助项目(81173333)

张丽萍(1988-)，女，山东威海人，医学硕士，从事针刀的临床与研究。

郭长青(1959-)，男，教授，博士研究生导师，从事针刀理论与临床研究，E-mail:guochangqing66@163．com。