滑膜炎颗粒对Ⅱ型胶原诱导的关节炎模型改善作用的机制研究

孙丽华，李志刚，周艳华，崔海峰，朱宏伟，于友华，张志伟，王正品，孙明杰△

(1．北京市中医药防治重大疾病基础研究重点实验室，中国中医科学院医学实验中心，北京 100700;2．中药注射剂新药开发技术国家地方联合工程实验室，河北三河 065201; 3．神威药业集团有限公司，石家庄 051430;4．中国中医科学院望京医院，北京 100102; 5．河北省中药注射液工程技术研究中心，河北三河 065201)

滑膜炎颗粒对Ⅱ型胶原诱导的关节炎模型改善作用的机制研究

孙丽华1，李志刚2，3，周艳华1，崔海峰1，朱宏伟4，于友华1，张志伟2，3，王正品3，5，孙明杰1△

(1．北京市中医药防治重大疾病基础研究重点实验室，中国中医科学院医学实验中心，北京 100700;2．中药注射剂新药开发技术国家地方联合工程实验室，河北三河 065201; 3．神威药业集团有限公司，石家庄 051430;4．中国中医科学院望京医院，北京 100102; 5．河北省中药注射液工程技术研究中心，河北三河 065201)

目的:探讨滑膜炎颗粒对Ⅱ型胶原诱导的关节炎(CIA)模型改善作用机制。方法:牛Ⅱ型胶原乳剂大鼠尾根部皮下注射制备CIA模型，造模成功后按随机数字表法分为对照组(Ⅰ)、模型组(Ⅱ)、不完全弗氏佐剂组(Ⅲ)、雷公藤多苷片组(Ⅳ)、醋酸泼尼松龙组(Ⅴ)、滑膜炎颗粒大剂量组(Ⅵ)、中剂量组(Ⅶ)、小剂量组(Ⅷ)，每组各10～11只大鼠。免疫组化方法观察大鼠左膝关节滑膜组织IL-1、TNF-α、Erk、Jnk、Ras、Raf的表达，图像分析软件计算阳性面积比。结果:各造模组大鼠膝关节滑膜组织IL-1、Erk、Jnk、Ras、Raf表达量均较对照组增高;各给药组Erk表达量均较模型组降低，其中Ⅲ、Ⅳ、Ⅴ、Ⅵ组Erk表达量与模型组比较差异有统计学意义。结论:IL-1、Erk、Jnk、Ras表达升高，参与CIA模型大鼠滑膜组织病理损伤过程;滑膜炎颗粒改善关节损伤症状可能与降低Erk的表达相关，而与IL-1、TNF、Jnk、Ras、Raf不相关。

滑膜炎颗粒;胶原诱导关节炎模型;细胞因子;细胞外调节蛋白激酶

滑膜炎颗粒由夏枯草、女贞子、功劳叶、黄芪、防己、薏苡仁、土茯苓、丝瓜络、泽兰、丹参、当归、川牛膝、豨莶草组成，具有清热利湿、活血通络作用，临床用于急、慢性滑膜炎及膝关节术后的治疗。我们前期研究发现，滑膜炎颗粒对Ⅱ型胶原诱导的关节炎(CIA)模型具有较好的改善作用，对关节炎指数评分和足肿胀度均有不同程度的抑制作用，对CIA模型滑膜、软骨、纤维组织及小血管增生和炎性细胞浸润等病理损伤也有不同程度的改善作用。然而，滑膜炎颗粒对CIA模型改善作用的相关机制研究报道较少。有研究表明，活化的滑膜细胞产生的细胞因子(如IL-1、TNF-α)参与软骨破坏的病理过程，其中IL-1是导致软骨损伤的重要因素之一［1］;滑膜细胞MAPKs信号传导通路异常也是骨关节损伤的重要发病机制之一。因此，本文应用免疫组化方法对CIA模型滑膜组织IL-1、TNF-α及MAPKs信号通路中关键酶(Erk、Ras、Jnk等)进行观察，以期阐明滑膜炎颗粒对CIA模型改善作用的相关机制。

1 材料与方法

1.1 材料

1.1.1 实验动物 SPF级雄性SD大鼠，体质量(160±10)g，购自中国人民解放军军事医学科学院实验动物中心(合格证号SCXK-(军)2007-004)。实验在中国中医科学院中医基础理论研究所实验动物屏障环境中进行(许可证号 SYXK(京)2010-0032)，并按实验动物使用的3R原则给予人道关怀。

1.1.2 药品与试剂 滑膜炎颗粒，由神威药业(张家口)有限公司提供;雷公藤多苷片(TGT)，黄石飞云制药有限公司生产(批号20111201);醋酸泼尼松龙片，上海信谊药厂有限公司生产(批号120402);牛Ⅱ型胶原(批号120287)、不完全弗氏佐剂(批号120326)，购自美国Chondrex公司。免疫组化抗体(IL-1、Erk、Jnk、TNF-α、Raf、Ras)均购自美国Abcam公司。

1.2 实验方法

1.2.1 实验分组 动物购进后适应性喂养2 d，制备CIA模型，模型制备成功后按随机数字表法分为8组，每组10～11只大鼠，分别为对照组(Ⅰ)、不完全弗氏佐剂组(Ⅱ)、模型组(Ⅲ)、雷公藤多苷组(Ⅳ)、醋酸泼尼松龙组(Ⅴ)、滑膜炎颗粒大剂量组(Ⅵ)、中剂量组(Ⅶ)、小剂量组(Ⅷ)。

1.2.2 CIA模型的制备 参照文献［2］取Ⅱ型胶原乳剂注射于大鼠尾根部皮下0.2 mL/只，7 d后加强免疫1次，0.2 mL/只注射于大鼠尾根部皮下;对照组注射生理盐水，佐剂组注射不完全弗氏佐剂。造模成功后，按足趾肿胀度调整各造模组动物，剔除未成模大鼠。

1.2.3 给药方法 加强免疫6 d后开始给药，对照组、不完全弗氏佐剂组及模型组给予等体积纯水。雷公藤多苷片9.45 mg/kg，醋酸泼尼松龙2.70 mg/kg，滑膜炎颗粒分为大、中、小3个给药剂量，分别为9.68 g生药/kg、4.84 g生药/kg，2.42 g生药/ kg。给药体积2 mL/100 g，每天1次，连续灌胃给药36 d。

1.2.4 滑膜组织免疫组化方法 末次给药后24 h，20%乌拉坦麻醉大鼠，取大鼠左膝关节固定于10%中性福尔马林溶液中，常规酒精脱水，二甲苯处理，石蜡包埋，2 μm连续切片烤干备用。按照免疫组化标准操作流程操作。图像分析采用病理组织实时摄像显微镜系统摄像，胞浆内棕色颗粒为阳性标记，图像分析软件(MIAS)计算阳性面积比(阳性染色面积/斑块总面积)。

1.3 统计学方法

采用SPSS 13.0软件进行统计分析，计量资料以均数±标准差(±s)表示，组间比较采用单因素方差分析，P＜0.05为差异有统计学意义。

2 结果

2.1 滑膜炎颗粒对CIA大鼠膝关节滑膜组织IL-1表达的影响

图1表1显示，对照组滑膜组织结构大致正常;模型组滑膜组织上皮1～2层，滑膜下小血管明显增生，可见血管翳形成，并见少许炎细胞浸润;不完全佐剂组滑膜组织及软骨组织、结构大致正常;雷公藤组滑膜组织上皮1～2层，偶见3层，有少许小血管增生，滑膜下未见明确炎细胞浸润;醋酸泼尼松龙组可见滑膜组织及少许软骨组织，滑膜上皮1～2层，滑膜下未见小血管增生及明确炎细胞浸润;滑膜炎颗粒大剂量组滑膜组织上皮2层，轻度增生，颗粒层轻度增生肥厚，滑膜下见少许小血管增生及少许慢性炎细胞浸润;滑膜炎颗粒中剂量组滑膜组织上皮2层，颗粒层轻度增生肥厚，滑膜下见小血管中度增生及少许慢性炎细胞浸润;滑膜炎颗粒小剂量组滑膜组织上皮1`2层，颗粒层轻度增生肥厚，滑膜下见少许小血管增生及少许慢性炎细胞浸润。软件分析图片结果显示，各组大鼠膝关节滑膜组织IL-1表达量均较对照组增高，与对照组比较差异有统计学意义(P＜0.01)。中剂量组IL-1表达增高显著，与模型组及不完全佐剂组比较差异有统计学意义。

表1 滑膜炎颗粒对CIA大鼠膝关节滑膜组织IL-1表达的影响(±s)

表1 滑膜炎颗粒对CIA大鼠膝关节滑膜组织IL-1表达的影响(±s)

注:与对照组比较:*P＜0.05，＊＊P＜0.01;与模型组比较:▼P ＜0.05，▼▼P＜0.01;与不完全佐剂组比较:△P＜0.05，△△P＜0.01

组别 剂量g/kg 平均灰度对 照 组 —107.77±16.87 模 型 组 — 130.25±18.32＊＊不完全佐剂组 — 129.93±14.10＊＊雷 公 藤 组 0.0095 136.38±9.62＊＊醋酸泼尼松龙组 0.0027 125.50±14.20＊＊大 剂 量 组 9.6800 134.40±9.57＊＊中 剂 量 组 4.8400 146.71±12.53＊＊▼△△小 剂 量 组 2.4200 132.78±16.76＊＊

图1 滑膜炎颗粒对大鼠膝关节滑膜组织IL-1表达的影响(×400)

2.2 滑膜炎颗粒对CIA大鼠膝关节滑膜组织TNF-α表达的影响

表2显示，滑膜炎颗粒大剂量、小剂量组大鼠膝关节滑膜组织TNF-α表达量较对照组增高，其余各组TNF-α表达量较对照组降低，其中不完全佐剂组、醋酸泼尼松龙组与对照组比较差异有统计学意义(P＜0.01);不完全佐剂组、醋酸泼尼松龙组与模型组比较差异有统计学意义(P＜0.01);雷公藤组、滑膜炎颗粒各剂量组与不完全佐剂组比较差异有统计学意义。

表2 滑膜炎颗粒对CIA大鼠膝关节滑膜组织TNF-α表达的影响(±s)

表2 滑膜炎颗粒对CIA大鼠膝关节滑膜组织TNF-α表达的影响(±s)

注:与对照组比较:*P＜0.05，＊＊P＜0.01;与模型组比较:▼P＜0.05，▼▼P＜0.01;与不完全佐剂组比较:△P＜0.05，△△P＜0.01

组别 剂量g/kg 平均灰度对 照 组 —87.56±20.73 模 型 组 — 85.90±12.45不完全佐剂组 — 64.42±13.28＊＊▼▼雷 公 藤 组 0.0095 83.55±13.38△△醋酸泼尼松龙组 0.0027 68.04±12.54＊＊▼▼大 剂 量 组 9.6800 92.62±12.67△△中 剂 量 组 4.8400 86.30±11.99△△小 剂 量 组 2.4200 97.28±12.43△△

2.3 滑膜炎颗粒对CIA大鼠膝关节滑膜组织Erk表达的影响

表3显示，各组大鼠膝关节滑膜组织Erk表达量均较对照组增高，除不完全佐剂组，其余各组与对照组比较差异有统计学意义(P＜0.05或 P＜0.01)。各给药组Erk表达量均较模型组降低，其中不完全佐剂组、雷公藤组、醋酸泼尼松龙组、大剂量组Erk表达量与模型组比较差异有统计学意义(P ＜0.05或P＜0.01)。各给药组Erk表达量较不完全佐剂组增高，与不完全佐剂组比较差异有统计学意义。

表3 滑膜炎颗粒对CIA大鼠膝关节滑膜组织Erk表达的影响(±s)

表3 滑膜炎颗粒对CIA大鼠膝关节滑膜组织Erk表达的影响(±s)

注:与对照组比较:*P＜0.05，＊＊P＜0.01;与模型组比较:▼P＜0.05，▼▼P＜0.01;与不完全佐剂组比较:△P＜0.05，△△P＜0.01

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2.4 滑膜炎颗粒对CIA大鼠膝关节滑膜组织Jnk表达的影响

表4显示，各组大鼠膝关节滑膜组织Jnk表达量均较对照组增高，其中模型组、中剂量组、小剂量组与对照组比较差异有统计学意义，中剂量、小剂量组与不完全佐剂组比较差异有统计学意义。

表4 滑膜炎颗粒对CIA大鼠膝关节滑膜组织Jnk表达的影响(±s)

表4 滑膜炎颗粒对CIA大鼠膝关节滑膜组织Jnk表达的影响(±s)

注:与对照组比较:*P＜0.05，＊＊P＜0.01;与不完全佐剂组比较:△P＜0.05，△△P＜0.01

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2.5 滑膜炎颗粒对CIA大鼠膝关节滑膜组织Ras表达的影响

表5显示，各组大鼠膝关节滑膜组织Ras表达量均较对照组增高，除不完全佐剂组，其余各组与对照组比较差异均有统计学意义(P＜0.05或P＜0.01)。

表5 滑膜炎颗粒对CIA大鼠膝关节滑膜组织Ras表达的影响(±s)

表5 滑膜炎颗粒对CIA大鼠膝关节滑膜组织Ras表达的影响(±s)

注:与对照组比较:*P＜0.05;与对照组比较:＊＊P＜0.01

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2.6 滑膜炎颗粒对CIA大鼠膝关节滑膜组织Raf表达的影响

表6显示，各组大鼠膝关节滑膜组织Raf表达量均较对照组增高，其中醋酸泼尼松龙组、滑膜炎颗粒各剂量组与对照组比较差异有统计学意义(P＜0.05或P＜0.01)。

表6 滑膜炎颗粒对CIA大鼠膝关节滑膜组织Raf表达的影响(±s)

表6 滑膜炎颗粒对CIA大鼠膝关节滑膜组织Raf表达的影响(±s)

注:与对照组比较:*P＜0.05，＊＊P＜0.01

组别 剂量g/kg 平均灰度对 照 组 —95.07±6.88 模 型 组 — 112.16±16.58不完全佐剂组 — 98.88±11.99 雷 公 藤 组 0.0095 102.40±12.44醋酸泼尼松龙组 0.0027 112.65±7.66＊＊大 剂 量 组 9.6800 111.32±9.74＊＊中 剂 量 组 4.8400 115.44±13.46＊＊小 剂 量 组 2.4200 112.16±11.93*

3 讨论

我们前期实验以CIA模型探讨滑膜炎颗粒对类风湿关节炎(RA)改善作用，发现CIA模型大鼠滑膜增生、炎细胞浸润、软骨破坏与RA临床特征相一致，滑膜炎颗粒各剂量组能够改善足趾肿胀程度和关节炎指数评分［3］。RA病理改变可能是多种因素共同作用的结果，其中炎性细胞因子在损伤病理过程中发挥着重要作用［4］。在炎性因子中，IL-1和TNF-α对软骨破坏起着关键作用，它们能够刺激软骨细胞和滑膜细胞自分泌，并能诱导其产生其他细胞因子［5-6］。此外，IL-1能够诱导成纤维细胞的增生，并可增加成纤维细胞产生胶原酶。本研究显示，各组大鼠膝关节滑膜组织IL-1的表达量均较对照组升高，与对照组比较差异有统计学意义。滑膜炎颗粒中剂量组IL-1的表达量较模型组增加，与模型组比较差异有统计学意义。雷公藤组IL-1、TNF-α表达情况与滑膜炎颗粒各剂量组变化趋势相同。醋酸泼尼松组能够降低滑膜组织TNF-α的表达，而滑膜炎颗粒各剂量组与模型组比较差异无统计学意义，表明滑膜炎颗粒、雷公藤对关节的改善作用可能与IL-1、TNF不相关。醋酸泼尼松改善模型大鼠病理损伤作用与降低滑膜组织TNF-α的表达相关。

滑膜细胞信号传导异常是骨关节损伤的重要发病机制之一。在异常的信号传导中，免疫细胞相互作用引起细胞活化、增殖、迁移能力和细胞存活的改变，最终引发炎症［7］。MAPKs级联信号通路异常参与滑膜炎症和组织破坏的过程，表现为Erk高度活化，Jun氨基末端激酶(Jnk)异常表达［8］。本实验显示，除不完全佐剂组外，各组大鼠Erk表达均较对照组增强，与对照组比较差异有统计学意义。各给药组Erk表达量均较模型组降低，雷公藤组、醋酸泼尼松龙组、滑膜炎颗粒大剂量组与模型组比较差异有统计学意义。Jnk的表达，各组与模型组比较差异无统计学意义，提示Erk可能是滑膜炎颗粒改善关节症状的重要信号分子。

细胞外信号相关激酶(ERK)是一个广泛表达在细胞内的信号传导路径，在ERKs的传递途径中，Ras作为上游激活蛋白是单聚体GTP结合蛋白，它可通过Raf/MEK/ERK激酶级联把丝裂原信号从细胞浆膜传递到细胞核。Raf作为MAPKKK，是一个丝氨酸-苏氨酸激酶，它可磷酸化活化 MEK1/2，MEK1/2依次磷酸化ERK1/2，该路径通过一系列磷酸化作用控制细胞的增殖、分化和凋亡等功能［9］。本研究显示，各造模组Ras、Raf表达量较对照组增高，与对照组比较差异有统计学意义;滑膜炎颗粒各剂量组与模型组比较差异无统计学意义。提示CIA大鼠造模成功，Ras-Raf-ERK信号通路参与模型的病理损伤，滑膜炎颗粒改善模型大鼠关节损伤症状与Ras、Raf表达不相关。

综上我们研究发现，CIA模型大鼠IL-1、Erk、Jnk、Ras表达升高，参与滑膜组织病理损伤过程;滑膜炎颗粒改善关节损伤症状与降低Erk的表达相关，而与IL-1、TNF、Jnk、Ras、Raf不相关。RA的病理过程复杂，滑膜炎颗粒对其改善作用机制仍需进一步深入探讨。

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Study on the Mechanism of the Effects of Huamoyan Granule on the Arthritis Model Induced by to Type II Collagen

SUN Li-hua1，LI Zhi-gang2，3，ZHOU Yan-hua1，CUI Hai-feng1，ZHU Hong-wei4，YU You-hua1，ZHANG Zhi-wei2，3，WANG Zheng-pin3，5，SUN Ming-jie1△
(1．Beijing Key Laboratory of TCM Basic Research on Prevention and Treatment of Major Disease，Experimental Research Center，China Academy of Chinese Medical Sciences，Beijing 100700，China;2．State and Local Area Jointed Laboratory of Engineering for New Drug Development Technology of TCM Injection，Sanhe 065201，China;3．Shineway Pharmaceutical Group，Shijiazhuang 051430，China;4．Wangjing Hospital，China Academy of Chinese Medical Sciences，Beijing 100102，China;5．Hebei Engineering Technology Research Center of TCM Injection，Sanhe 065201，China)

Objective:To investigate the potential mechanism of the ameliorated effect of Huamoyan Granule on the collagenⅡinduced arthritis(CIA)model．Methods:CIA models were established by the subcutaneous injection of type Ⅱbovine collagen on the extremital tail of the rats．Successful models of rats were randomly divided into 8 groups(10 to 11 rats each)，the normal group(I)，model group(Ⅱ)，incomplete Freund’s adjuvant group(Ⅲ)，tripterygium glycosides tablet group(Ⅳ)，prednisolone acetate group(Ⅴ)，Huamoyan Granule high dose group(Ⅵ)，Huamoyan Granule middle dose group(Ⅶ)，Huamoyan Granule low dose group(Ⅷ)．The expression of IL-1，TNF-α，Erk，Jnk，Ras，Raf were observed by immunohistochemisty methods．The rate of positive expression area was measured by image software(MIAS)．Results:Compared with control group，the expression of IL-1，Erk，Jnk，Ras，Raf in the synovial tissue of rats’left knee joint were increased in all model groups．Compared with model group，the expression of Erk in groupⅢ，Ⅳ，Ⅴ，Ⅵwere decreased，and there were statistical significance．Conclusion:The high expressions of IL-1，Erk，Jnk，Ras，Raf might contribute to the pathologic events of CIA model．The decreased expression of Erk might be the potential mechanism of therapeutic effect on the synovial injury of Huamoyan Granule．The expressions of IL-1，TNF，Jnk，Ras，Raf might not relate with the ameliorated effect of Huamoyan Granule．

Humoyan Granule;CIA model;Cytokines;Erk

R285．5

B

1006-3250(2015)10-1241-04

2015-03-23

孙丽华(1978-)，女，吉林抚松人，副研究员，医学博士，从事中药药理的临床与研究。

孙明杰(1962-)，研究员，从事中医基础理论与中药药理研究，Tel:010-64089512，E-mail:sunmj62@tom．com。