经侧脑室给予中药对慢性心衰大鼠血流动力学与神经内分泌因子的影响*

秘红英，唐思文，贾存勤，徐登峰，郎艳松，贾振华

(1．河北医科大学，石家庄 050017;2．河北以岭医药研究院，国家中医药管理局重点研究室/心脑血管络病，石家庄 050035;3．河北省中西医结合医药研究院，石家庄 050035; 4．河北医科大学附属以岭医院/国家中医药管理局中医络病学重点学科，石家庄 050035)

经侧脑室给予中药对慢性心衰大鼠血流动力学与神经内分泌因子的影响*

秘红英1，2，唐思文2，贾存勤2，徐登峰1，2，郎艳松1，2，贾振华1，3，4△

(1．河北医科大学，石家庄 050017;2．河北以岭医药研究院，国家中医药管理局重点研究室/心脑血管络病，石家庄 050035;3．河北省中西医结合医药研究院，石家庄 050035; 4．河北医科大学附属以岭医院/国家中医药管理局中医络病学重点学科，石家庄 050035)

目的:观察采用微量注射泵经侧脑室给予中药芪苈强心胶囊对慢性心衰大鼠血流动力学、神经内分泌因子的影响。方法:采用结扎冠状动脉左前降支建立急性心肌梗死致大鼠心衰模型，造模4周后经侧脑室分别给予芪苈强心脑脊液和芪苈强心溶液，以阳性药CRH竞争性抑制剂(αh-CRH)作为对照，给药4周后应用颈动脉插管测定各组大鼠血流动力学指标，ELISA法检测大鼠血清脑利钠肽(BNP)、血浆去甲肾上腺素(NE)，RT-PCR法检测下丘脑促肾上腺皮质激素释放激素(CRH)mRNA与脑垂体促肾上腺皮质激素(ACTH)mRNA的表达。结果:芪苈强心脑脊液组、芪苈强心溶液组、阳性药组均可改善心衰大鼠血流动力学，降低大鼠血清BNP、血浆NE，并可降低下丘脑组织CRH mRNA与脑垂体组织ACTH mRNA的表达。结论:经侧脑室给予复方中药芪苈强心可有效改善大鼠血流动力学，降低血液中神经内分泌因子的含量与下丘脑CRH mRNA、脑垂体ACTH mRNA的表达，影响心衰大鼠中枢改变，有助于治疗心衰。

慢性心力衰竭;下丘脑;脑垂体;促肾上腺皮质激素释放激素

心力衰竭(HF)是冠心病、高血压等多种心血管疾病的“共同终末阶段”［1］。近年来，心衰机制的研究不断深入，研究者发现中枢神经系统在心衰的发生发展过程中起着重要作用，尤其是下丘脑部位，在调节交感神经活动和神经体液信号方面发挥着关键作用。随着心衰机制研究的转变，对于心衰的治疗也从外周给药转向中枢给药，使药物直接作用于中枢神经系统，影响中枢的改变，并由单纯的西医治疗转向中西医结合治疗，中药复方芪苈强心胶囊对心衰的治疗疗效日益突出。本实验采用微量注射泵经心衰大鼠侧脑室连续给药4周，观察芪苈强心胶囊对心衰大鼠血流动力学、脑利钠肽(BNP)、去甲肾腺素(NE)、下丘脑促肾上腺皮质激素释放激素(CRH)mRNA和脑垂体促肾上腺皮质激素(ACTH) mRNA表达的影响，探讨其对中枢系统及神经内分泌因子的作用机制。

1 材料与方法

1.1 材料

1.1.1 实验动物 选用SPF级SD雄性大鼠90只，体质量220～250 g，由北京富豪实验动物养殖中心提供(许可证号SCXK(京)2009-0017)。

1.1.2 药物 ①复方中药芪苈强心胶囊由石家庄以岭药业股份有限公司提供，药物组成为黄芪、人参、附子、丹参、葶苈子、泽泻、玉竹、桂枝、红花、香加皮、陈皮(批号120201)。注入大鼠侧脑室的芪苈强心胶囊粉经药学方法醇化，并用人工脑脊液配置成浓度20 mg/ml的溶液。含芪苈强心的脑脊液是在用0.1 g/ml的芪苈强心溶液灌胃(按1 g/kg剂量灌胃)新西兰兔后，在30'、60'、90'、150'分别取脑脊液将其混合，经药学方法检测脑脊液中含有芪苈强心成分后使用;②人工脑脊液(ACSF):NaHCO32184 mg/L、KCl 245.85 mg/L、KH2PO4163.2 mg/L、NaCl 7254 mg/L、MgSO4288 mg/L、CaCl2277.5mg/L、葡萄糖1800 mg/L(湖州英创生物科技有限公司，批号13061901);③阳性药αh-CRH，其可抑制下丘脑CRH的释放，对心衰产生影响［2］(美国Sigma公司，批号119K4839)。

1.1.3 主要试剂 大鼠BNP酶联免疫吸附试验试剂盒，北京艾迪康医学检验研究所(批号E02B0452);大鼠NE酶联免疫吸附试验试剂盒，河北博海生物科技有限公司(批号201308)。

1.1.4 主要仪器 脑立体定位仪，淮北正华生物仪器有限公司;ZH-RXZ型柔性颅骨钻，淮北正华生物仪器有限公司;HX-300小动物呼吸机、BL-420E生物机能实验系统，成都泰盟科技有限公司;微量注射泵，DURECT公司;756型紫外分光光度计，美国 Thermo公司;ABI 7300 Real-Time PCR System，美国ABI公司;RS-28高速低温离心机，德国贺利氏公司。

1.2 方法

1.2.1 分组及处理 先将90只大鼠按随机数字表法分为3组，正常组15只，假手术组15只和造模组60只。造模组大鼠经心脏左心耳下距主动脉根约1.5 mm处结扎左冠状动脉前降支(假手术组只穿线不结扎)，具体方法参考文献［3］。造模4周后，将造模组大鼠按随机数字表法分为模型组、阳性药组、芪苈强心脑脊液组、芪苈强心溶液组各15只。假手术组、模型组给予空白人工脑脊液，阳性对照组给予αh-CRH，芪苈强心脑脊液组给予含芪苈强心胶囊成分的脑脊液，芪苈强心溶液组给予20 mg/ml的芪苈强心溶液，各组分别经侧脑室连接微量注射泵以0.25 μL/h的速度连续给药4周。

1.2.2 微量注射泵装药与植入 严格按照说明书将药物装入微量注射泵，保证微量注射泵无气泡。将装好药物的微量注射泵植入大鼠体内，将大鼠麻醉后固定在水平桌面调整好立体定位仪，确定导管的安装位置和解剖位置:前骨缝的交点处即前囟沿着中骨缝向前约1.5 mm，水平离中骨缝向右约1.5 mm的位置。使立体定位仪上方钢针的针头对准导管安装的位置，在此位置打孔。将导管安装在打好的孔内慢慢插入侧脑室，大概在颅骨以下4.5 mm处。将导管用专用的胶水固定在颅骨上然后缝合颅骨皮肤，腹腔注射适量青霉素以消炎。术后的注意观察大鼠的行为变化、手术部位有无感染。

1.2.3 大鼠血流动力学测定 经左侧颈动脉插管，将充有肝素-生理盐水的导管逆行插入左心室，连接压力换能器，采用多导生理记录仪记录左心室收缩压(LVSP)、左室舒张末压(LVEDP)和左室内压最大上升和下降速率(±dp/dtmax)［4］。

1.2.4 大鼠血清脑利钠肽(BNP)与血浆去甲肾上腺素(NE)的检测 经查阅文献与 BNP［5］、NE［6］在不同血液成分中的含量，采用检测血清BNP与血浆NE法。采用腹主动脉取血，取出的血液分装为A、B两管，A管抗凝处理，B管不做处理，均放置室温1 h，再4℃、3000 r/min离心15 min，分别取其上清于EP管，ELISA法检测血清BNP与血浆NE水平，操作过程严格按照试剂盒说明书进行，设立标准品的浓度，通过酶标仪拟合出标准曲线，检测待测孔的OD值，分别得出样本BNP与NE的含量。

1.2.5 下丘脑组织CRH mRNA与脑垂体组织ACTH mRNA表达的检测 首先进行RNA提取，取组织于冰浴匀浆器中，加入1 ml Trizol研磨成匀浆，加入200 ul氯仿震荡30 s，离心取上层转移至另一离心管中，加入等体积的异丙醇混匀，－20℃静置2 h离心弃上清，加入1 ml 75%乙醇混匀，离心吸净上清液晾干，加入20 ul DEPC处理的去离子水溶解沉淀。提取后对RNA纯度与完整性进行检测;反转录，Syber Green荧光定量PCR的检测;进行实时荧光定量PCR结果分析，其中CRH mRNA与ACTH mRNA的引物信息分别为101 bp，上游:5'-ACCTCA ACAGAAGTCCCGC-3'，下游:5'-AAAGTTAGCCGCA GCCTG-3'和120 bp，上游:5'-ATTCTGCTACAGTC GCTCAGG-3'，下游:5'-AGGTTGCTTTCCGTGGTGA-3'，最后以GAPDH(GAPDH 120 bp，上游:5'-TGAA CGGGAAGCTCACTGG-3'，下游:5'-GCTTCACCACCT TCTTGATGTC-3')为内参照基因对比，得到目的基因的相对定量值(RQ值)。

1.2.6 统计学方法 采用SPSS 17.0软件进行统计分析，数据结果描述以均数±标准差(±s)表示，数据分析采用单因素方差分析法，组间两两比较，采用q检验，P＜0.05为差异有统计学意义。

2 结果

2.1 各组大鼠血流动力学变化

与假手术组比较，模型组大鼠LVEDP显著升高，LVSP、±dp/dtmax明显降低(P＜0.01);与模型组比较，阳性药组、芪苈强心脑脊液组、芪苈强心溶液组可降低LVEDP水平，升高LVSP、±dp/dtmax水平，以阳性药组和芪苈强心溶液组最为显著(P＜0.05，P＜0.01)。

表1 各组大鼠大鼠血流动力学变化比较(±s)

表1 各组大鼠大鼠血流动力学变化比较(±s)

注:与假手术组比较:#P＜0.05，##P＜0.01;与模型组比较:*P＜0.05，＊＊P＜0.01(下同)

组别 鼠数 LVSP(mmHg) LVEDP(mmHg) +dp/dtmax(mmHg/ms) －dp/dtmax(mmHg/ms) 空 白 对 照 组 15 112.231±12.29 3.911±2.49 4.313±0.52 3.868±0.41 假 手 术 组 15 104.877±19.72 5.125±1.47 4.011±0.83 3.463±0.77 模 型 组 15 90.301±18.66##9.994±2.45##2.320±0.59##2.100±0.34##阳 性 对 照 组 15 108.206±11.66＊＊4.837±1.30＊＊3.436±0.34＊＊3.104±0.31＊＊芪苈强心脑脊液组 15 103.500±11.27*6.109±1.86＊＊3.202±0.70＊＊3.215±0.48＊＊芪苈强心溶液组 15 107.389±11.10＊＊4.978±1.65＊＊3.510±0.44＊＊3.131±0.32＊＊

2.2 各组大鼠血清BNP、NE含量变化

与假手术组比较，模型组BNP、NE含量均显著增加(P＜0.01);与模型组比较，阳性药组、芪苈强心脑脊液组、芪苈强心溶液组均可不同程度降低BNP、NE的含量(P＜0.05，P＜0.01)。

表2 各组大鼠血清BNP与血浆NE含量的变化(±s)

表2 各组大鼠血清BNP与血浆NE含量的变化(±s)

注:与假手术组比较:#P＜0.05，##P＜0.01;与模型组比较:*P ＜0.05，＊＊P＜0.01

组别 鼠数 BNP(pg/ml) NE(pg/ml)空 白 对 照 组9 6.564±1.08 245.375±56.26 假 手 术 组 9 7.818±1.83 243.317±34.14 模 型 组 9 11.162±2.38##331.777±36.80##阳 性 对 照 组 9 5.447±0.93＊＊249.940±22.59＊＊芪苈强心脑脊液组 9 8.825±2.00*251.300±27.46＊＊芪苈强心溶液组 9 7.249±1.36＊＊259.975±39.35＊＊

2.3 各组大鼠下丘脑CRH mRNA和脑垂体ACTH mRNA表达水平变化

与假手术组比较，模型组下丘脑CRH mRNA、脑垂体 ACTH mRNA表达水平显著升高(P＜0.01);与模型组比较，阳性药组、芪苈强心脑脊液组、芪苈强心溶液组下丘脑CRH mRNA、脑垂体ACTH mRNA表达水平显著下降(P＜0.01)

表3各组大鼠下丘脑CRH mRNA与垂体ACTH mRNA表达的变化(±s)

表3各组大鼠下丘脑CRH mRNA与垂体ACTH mRNA表达的变化(±s)

注:与假手术组比较:#P＜0.05，##P＜0.01;与模型组比较:*P ＜0.05，＊＊P＜0.01

组别 鼠数CRH mRNA ACTH mRNA空 白 对 照 组6 0.978±0.30 1.130±0.22 假 手 术 组 6 0.946±0.13 1.331±0.46 模 型 组 6 3.133±0.39##5.415±0.70##阳 性 对 照 组 6 1.113±0.29＊＊2.771±0.98＊＊芪苈强心脑脊液组 6 1.222±0.17＊＊2.921±0.49＊＊芪苈强心溶液组 6 1.870±0.39＊＊3.160±0.75＊＊

3 讨论

随着中国医学的发展，中医药在治疗心衰方面的优势日益凸显。研究人员发现，芪苈强心胶囊组方中药物的作用机理与现代医学药物有许多共同之处。药理研究表明，附子具有拟交感作用，其有效成分乌头碱有较强的强心作用［7］;人参可增加心肌细胞内cAMP的含量［8］。临床实验显示，附子人参合用可使心衰患者血清BNP水平显著降低［9］，因此芪苈强心胶囊在治疗心衰时具有多靶点、多途径、多环节的特点与优势。

目前对心衰发病机制的研究显示，在心衰过程中心功能会密切随着心衰的发展及转归发生变化，且中枢神经系统的激活有着关键的作用，多种神经体液信号参与其中［10］。通过检测心功能可以得到心脏的舒缩及射血情况，从而直接反映心衰。BNP对评定心衰的发生发展与预后有重要的意义，而心衰时NE在外周血的含量可作为反映交感神经兴奋状态的指标。下丘脑可分泌多种激素，其中较为重要的是CRH，其可诱导ACTH释放入血，发挥重要的神经内分泌功能［11］。而过多的NE也可刺激下丘脑释放更多的CRH，从而使ACTH能系统的活性升高，并会增强外周交感神经活动。本实验运用微量注射泵连续将药物泵入心衰大鼠侧脑室，4周后与模型组比较，各给药组大鼠均改善了心衰大鼠血流动力学，使血清BNP和血浆NE水平明显降低，可明显降低下丘脑CRH mRNA与脑垂体ACTH mRNA的表达。同时本实验设定芪苈强心胶囊脑脊液组与芪苈强心溶液组，旨在说明芪苈强心胶囊中的某些成分以某种方式进入脑脊液，影响中枢的改变，而2组实验数据也证明了这一点，其中的机制尚待进一步研究。

综上所述，心衰过程中可能存在中枢神经系统的某些变化，影响心衰的发生发展和预后，经中枢给药可以有效改善心衰，而中药复方经特殊处理后用特殊的装置注入侧脑室，可延缓心衰的进展，改善心衰预后。这一研究对于临床心衰的治疗尤其是中药复方芪苈强心胶囊对心衰的治疗有着重要的指导意义，更加明确了心衰发病的中枢机制，为进一步心衰治疗过程中寻找药物治疗新的靶点奠定了基础，但其中的机制尚未完全明确，需要进一步的实验研究。

［1］ Mommersteeg PM，Denollet J，SPertus JA，et al．Health status as a risk factor in cardiovascular disease:a systematic review of current evidence［J］．Am Heart J，2009，157(2):208-218．

［2］ 郭周威，宿宇坤，马英，等．下丘脑室旁核氧化应激反应对心力衰竭时肾交感神经活动的影响［J］．中西医结合心脑血管病杂志，2009，7(6):694-695．

［3］ 郭艳琳．下丘脑室旁核CRH神经元激活在慢性充血性心力衰竭中的交感兴奋作用及机制研究［D］．太原:山西医科大学，2011．

［4］ 黄平东，罗懿明，刘煜德，等．益气温阳活血利水药对心肌梗死后心力衰竭大鼠心功能和脑钠肽的影响［J］．中西医结合心脑血管病杂志，2008，6(5):538-539．

［5］ 张璐，白梅．芪苈强心胶囊对慢性心力衰竭患者心率变异性及血清脑利钠肽的影响［J］．中国药物与临床，2013，7(13): 949-951．

［6］ 黄衍寿，冼绍祥．保心康治疗气阳虚型充血性心力衰竭的临床研究［J］．中药新药与临床药理，2000，11(5):261-265．

［7］ 黄斌．芪苈强心胶囊对慢性收缩性心力衰竭患者心功能及血浆脑利钠肽水平的影响［J］．中国实验方剂学杂志，2010，16(16):191．

［8］ 王本祥，马金凯，邓文龙．现代中药药理学［M］．天津:天津科学技术出版社，1997:452-642．

［9］ Felder RB，Yu Y，Zhang ZH，et al．Pharmacological treatment for heart failure:a view from the brain［J］．Clin Pharmacol Ther，2009，86(2):216-220．

［10］ 谭浩，许民辉，周继红．CRH在中枢神经系统中的作用．国外医学·生理、病理科学与临床分册，2002，22(6):615-617．

Effects of Chinese Herbal Medicine on Hemodynamics and Neuroendocrine Factors in Chronic Heart Failure Rats

MI Hong-ying1，2，TANG Si-wen2，JIA Chun-qin2，XU Deng-feng2，LANG Yan-song1，2，JIA Zhen-hua1，3，4△
(1．Hebei Medical University Shijiazhuang 050017，China;2．Yiling Medical Research Institute of Hebei Province，Shijaizhuang 050035，China;3．Key Laboratory of State Administration of Traditional Chinese Medicine/cardio-cerebral vascular network disease，Shijaizhuang 050035，China;4．IntegrativeMedicineInstituteof Hebei Province，Shijiazhuang 050035，China)

Objective:To investigate the impact of the lateral ventricle administered by syringe pump on blood flow dynamics and neuroendocrine factors in chronic heart failure rats．Methods:To establish the acute myocardial infarctioninduced heart failure in rats by the left anterior descending coronary artery ligation．The rats were given Qiliqiangxin cerebrospinal fluid，Qiliqiangxin solution and CRH competitive inhibitor(αh-CRH)by the left ventricle for four weeks after modeling．Four weeks after administration，carotid artery was used to measure blood flow dynamics indicators in rats in each group，ELISA was used to detect serum brain natriuretic peptide(BNP)and norepinephrine(NE)，and PCR was used to detect the expression of the hypothalamus CRH mRNA and the pituitary ACTH mRNA．Results:Qiliqiangxin cerebrospinal fluid group，Qiliqiangxin solution group and positive drug group can improve blood flow dynamics，lower serum BNP，plasma NE，and reduce the expression of CRH mRNA and ACTH mRNA in rats with heart failure．Conclusion:Giving compound Chinese medicine by the lateral ventricles can improve hemodynamics，reduce blood levels of neuroendocrine factors，lower the expression of CRH mRNA and ACTH mRNA，contribute to the treatment of heart failure，and impact the change of the central nervous in heart failure rats．

Chronic congestive heart failure;Hypothalamic;Pituitary gland;Corticotropin-releasing hormone

R285.5

B

1006-3250(2015)10-1232-03

2015-03-12

国家自然科学基金资助项目-慢性充血性心力衰竭大鼠下丘脑室旁核CRH神经元激活相关机制及芪苈强心胶囊干预研究(81273978);国家重点基础研究发展计划(973计划)项目-基于微血管病变“营卫生化，交络以通”(2012CB518606)

秘红英(1987-)，女，在读博士，从事中医心血管疾病的临床与研究。

贾振华(1975-)，男，医学博士，博士研究生导师，从事中医心血管疾病的临床与研究，Tel:13331356155，E-mail:jiazhenhuayling@．cn。