针刺足三里对对乙酰氨基酚在大鼠体内代谢过程中相关酶学的影响*

蒙光义，王冬晓，彭评志，庞家莲，严浩林，杨 斌，严 明

(1．广西玉林市第一人民医院，广西玉林 537000;2．广西玉林市妇幼保健院，广西玉林 537000; 3．广西医科大学药学院，南宁 530021)

针刺足三里对对乙酰氨基酚在大鼠体内代谢过程中相关酶学的影响*

蒙光义1，王冬晓2，彭评志1，庞家莲1，严浩林1，杨 斌3△，严 明3

(1．广西玉林市第一人民医院，广西玉林 537000;2．广西玉林市妇幼保健院，广西玉林 537000; 3．广西医科大学药学院，南宁 530021)

目的:研究针刺足三里对对乙酰氨基酚(Acetaminophen，APAP)在大鼠体内代谢过程中相关酶学活性的影响，以探讨其影响药物代谢的作用机制。方法:70只SD大鼠按随机数字表法分为APAPL组和AcupL组、APAPM组和AcupM组、APAPH组和AcupH组、正常对照组，7组大鼠给药或针刺后采集标本测定APAP代谢过程中相关酶学的活性。结果:与APAPM组和APAPH组比较，AcupM组和AcupH组血清谷胱甘肽S-转移酶(GST)活性显著提高，而肝脏GST活性明显减弱。与APAPM组和APAPH组比较，AcupM组和AcupH组肝脏线粒体Na+-K+-ATP酶、Ca2+-Mg2+-ATP酶和琥珀酸脱氢酶(SDH)活性明显降低。但针刺足三里对肝药酶Cyt．P450、Cyt．b5和NADPH-Cyt．P450还原酶活性的影响作用均不明显。结论:针刺足三里不通过抑制肝药酶而减慢APAP的代谢与消除，但随APAP给药剂量的增加，其会加重APAP对肝脏GST和能量代谢相关酶的抑制作用，减慢APAP的代谢与消除。

针刺;足三里;对乙酰氨基酚;谷胱甘肽S-转移酶;能量代谢相关酶;肝药酶;大鼠

中医理论认为，针刺足三里对机体具有双向调节、增强机体免疫功能的作用，对药物诱发的肝损伤具有保护作用，但其对诱发肝损伤药物在体内代谢和消除的影响作用机制尚不清楚。因此，明确针刺足三里对诱发肝损伤药物在肝脏代谢过程中相关酶学活性变化的作用机制，对阐明其影响药物在机体内的代谢及相关药代动力学过程的机制至关重要。对乙酰氨基酚(Acetaminophen，APAP)是临床上使用极其广泛的苯胺类解热镇痛药，过量使用或滥用都会诱发严重的肝毒性［1］。本研究通过观察针刺足三里对APAP在大鼠体内代谢过程相关酶学活性变化的影响，探讨针刺对药物代谢动力学影响的酶学机制，为研究针刺足三里对药源肝损伤的影响作用机制提供客观的参考依据。

1 材料

1.1 动物与分组

SDSPF级大鼠70只，雌雄各半，体质量(230± 20)g，由广西医科大学实验动物中心提供(动物使用许可证SYXK桂2003-0005)。按随机数字表法分为模型 L组、模型 M组、模型 H组(分别简称APAPL组、APAPM组、APAPH组)、电针L组、电针M组、电针H组(分别简称AcupL组、AcupM组、AcupH组)、空白对照组(简称NC组)7组各10只。

1.2 主要仪器

G6805-Ⅰ型针灸治疗仪(青岛鑫升实业有限公司);FJ-200高速分散匀浆机(上海标本模型厂); TDL-5型台式低速大容量离心机(上海安亭科学仪器厂);TGL-16GA型高速冷冻离心机(上海安亭科学仪器厂);722S可见光分光光度计(上海精密科学仪器有限公司);DU-640紫外-可见光分光光度计(美国 Beckman公司);超速冷冻离心机(美国Beckman公司)。

1.3 药品与试剂

对乙酰氨基酚片(中美天津史克制药有限公司，批号09050394);细胞色素C和 NADPH(美国Sigma公司，批号C8130和N8011);连二亚硫酸钠(广东汕头市西陇化工厂，批号0310202);谷胱甘肽(GSH)、谷胱甘肽S-转移酶(GST)、三磷酸腺苷酶(ATP酶)、琥珀酸脱氢酶(SDH)、蛋白定量试剂盒均购自南京建成生物工程公司研究所。

2 方法

2.1 给药方案

AcupL组、AcupM组、AcupH组大鼠分别按体质量灌胃给予APAP300、600、1200mg/kg，随后即刻固定在大鼠固定器并针刺其双侧后肢足三里穴20 min。同样，APAPL组、APAPM组、APAPH组大鼠分别按体质量灌胃给予APAP300、600、1200mg/kg，NC组大鼠则给予相同体积剂量的生理盐水，4组大鼠均于给药后同样固定在大鼠固定器内20min。各组大鼠于给药2h后采集标本进行相关酶学指标测定。

2.2 针刺方法

根据动物穴位定位图谱［2］，选取大鼠后肢双侧足三里穴于膝关节后外侧，腓骨小头下约5mm处直刺7mm，针刺后连接G6805-Ⅰ型针灸治疗仪持续电针刺激20min(电针治疗仪参数设定为疏密波，频率14Hz，强度以大鼠安静耐受为度，约1mA，保持大鼠清醒状态，以双下肢轻微抖动为宜)。

2.3 GSH含量和GST活性测定

采用摘除眼球取血方法，静置0.5～1.0h，3500 r/min离心15min，分离血清于4℃保存待测;处死大鼠，取肝脏右叶1g，加入9倍体积冰冷生理盐水于冰浴中制成10%(1∶9，W/V)肝匀浆，3500r/min离心15min分取上清液，于－20℃保存待测。分别采用二硫代二硝基苯甲酸法和化学比色法测定大鼠血清和肝脏组织匀浆液GSH含量和GST活性，肝脏组织匀浆液蛋白定量采用双缩脲法。

2.4 能量代谢相关酶活性测定

制备肝线粒体，将肝组织在冰浴中以预冷0.25 mol/L蔗糖溶液制成10%的匀浆，2000rpm，4℃离心20min，沉淀用预冷的0.25mol/L蔗糖溶液洗2次，合并上清液，10000rpm，4℃离心20min，沉淀物即为线粒体，所得沉淀用预冷的0.25mol/L蔗糖溶液洗2次，将线粒体悬浮于分离介质中供测定。采用定磷法按照ATP酶试剂盒说明书测定Na+-K+-ATP酶和Ca2+-Mg2+-ATP酶，采用化学比色法按照SDH试剂盒说明书测定SDH活性。

2.5 肝微粒体酶学活性测定

制备肝微粒体，取部分肝脏组织加入2倍体积的预冷15%甘油-20mmol/L磷酸盐缓冲液(PBS，pH7.4)，制备成肝匀浆。匀浆液以8000～10000 rpm离心15min，取上清液，再以40000rpm离心30 min，所得淡红色沉淀即为肝微粒体。将微粒体用预冷的匀浆介质制备成混悬液，用超声波破碎供酶学含量和活性测定。采用CO还原差示光谱法测定CytP450和Cytb5的含量，按照相关文献方法测定NADPH-CytP450还原酶活性［3-4］。

2.6 统计学方法

采用SPSS13.0软件进行统计分析，计量资料以均数±标准差(±s)表示，多组间均数比较采用方差分析，2组间比较采用t检验，P＜0.05为差异有统计学意义。

3 结果

3.1 针刺足三里对 APAP代谢过程中大鼠GSH和GST的影响

3.1.1 针刺足三里对APAP代谢过程中大鼠血清GSH和GST的影响 表1显示，APAP给药剂量为300mg/kg时，针刺对GSH含量和GST活性基本无影响(P＞0.05);给药剂量增加到600mg/kg时，针刺明显降低GSH含量(P＜0.05)，但对GST活性无影响(P＞0.05);给药剂量达到1200mg/kg时，针刺明显降低GSH含量(P＜0.01)和增强GST活性(P＜0.05)。结果提示，随着给药剂量的增大，针刺足三里影响APAP降低血清GSH含量和增强GST活性的作用越明显。

3.1.2 针刺足三里对APAP代谢过程中大鼠肝脏GSH和GST的影响 表2显示，APAP给药剂量为300mg/kg时，针刺对GSH含量和GST活性基本无影响(P＞0.05);给药剂量增加至600mg/kg和1200mg/kg时，针刺作用明显降低GSH含量和减弱GST活性(P＜0.01或P＜0.05)。结果提示，随着给药剂量的增大，针刺足三里影响APAP降低肝脏中GSH含量和抑制GST活性的作用越明显。

表1 针刺足三里对APAP代谢过程中大鼠血清GSH和GST的影响(±s)

表1 针刺足三里对APAP代谢过程中大鼠血清GSH和GST的影响(±s)

注:与NC组比较:△P＜0.05，△△P＜0.01;与相应模型组比较:*P＜0.05，＊＊P＜0.01

组别 鼠数 GSH(mg/L) GST(U/ml)空白对照组(NC组)10 52.57±11.10 51.03±10.65模型L组(APAPL组) 10 51.16±18.83 47.60±13.69电针L组(AcupL组) 10 55.04±12.41 53.42±7.40模型M组(APAPM组) 10 54.14±16.84 49.32±11.46电针M组(AcupM组) 10 41.77±7.39△＊ 56.68±9.26模型H组(APAPH组) 10 37.02±8.24△△ 72.95±16.09△△电针H组(AcupH组) 10 24.40±5.696△△＊＊94.69±17.15△△＊

3.2 针刺足三里对APAP代谢过程中大鼠肝脏能量代谢相关酶的影响

表3显示，对于Na+-K+-ATP酶，当APAP给药剂量为600或者1200mg/kg时，针刺作用明显降低其活性(P＜0.05或P＜0.01);对于 Ca2+-Mg2+-ATP酶，当给药剂量为600mg/kg时，针刺明显降低其活性(P＜0.05)。但在1200mg/kg剂量时，针刺对其活性影响作用不明显(P＞0.05);对于SDH，随着给药剂量的增大，针刺抑制其活性的作用越明显(P＜0.01)。结果提示，随着给药剂量的增大，针刺诱导APAP抑制肝脏线粒体能量代谢相关酶活性的作用越明显。

表2 针刺足三里对APAP代谢过程中大鼠肝脏GSH和GST的影响(±s)

表2 针刺足三里对APAP代谢过程中大鼠肝脏GSH和GST的影响(±s)

注:与NC组比较:△P＜0.05，△△P＜0.01;与相应模型组比较:*P＜0.05，＊＊P＜0.01

组别 鼠数 GSH(mg/gprot) GST(U/mgprot)空白对照组(NC组)10 1.54±0.28 25.97±4.49模型L组(APAPL组) 10 1.57±0.33 23.29±5.16电针L组(AcupL组) 10 1.49±0.30 24.18±6.02模型M组(APAPM组) 10 1.25±0.19△ 24.82±3.88电针M组(AcupM组) 10 1.04±0.11△△＊ 19.25±3.06△△＊＊模型H组(APAPH组) 10 1.07±0.17△△ 17.78±2.71△△电针H组(AcupH组) 10 0.84±0.12△△＊＊14.10±2.89△△＊

表3 针刺足三里对APAP代谢过程中大鼠肝脏ATP酶和SDH活性的影响(±s)

表3 针刺足三里对APAP代谢过程中大鼠肝脏ATP酶和SDH活性的影响(±s)

注:与NC组比较:△P＜0.05，△△P＜0.01;与相应模型组比较:*P＜0.05，＊＊P＜0.01

组别 鼠数 Na+-K+-ATP酶(μmolPi/mgprot/hour) Ca2+-Mg2+-ATP酶(μmolPi/mgprot/hour) SDH (U/mgprotr)空白对照组(NC组)10 0.139±0.049 0.130±0.034 7.35±0.69模型L组(APAPL组) 10 0.112±0.038 0.128±0.047 5.97±0.84△△电针L组(AcupL组) 10 0.125±0.043 0.107±0.022 6.24±1.08△模型M组(APAPM组) 10 0.106±0.033 0.115±0.029 6.19±0.81△△电针M组(AcupM组) 10 0.073±0.012△△＊ 0.087±0.014△△＊ 4.97±0.78△△＊＊模型H组(APAPH组) 10 0.081±0.023△△ 0.071±0.015△△ 5.07±0.52△△电针H组(AcupH组) 10 0.057±0.015△△＊＊ 0.074±0.018△△ 3.71±0.65△△＊＊

3.3 针刺足三里对APAP代谢过程中大鼠肝药酶的影响

表4显示，与NC组比较，各个APAP组和Acup组Cyt．P450、Cyt．P450和NADPH-Cyt．P450还原酶的含量和活性比较差异无统计学意义(P＞0.05);与相应APAP组比较，各个Acup组的Cyt．P450、Cyt．P450和NADPH-Cyt．P450还原酶含量和活性比较差异无统计学意义(P＞0.05)。结果提示，针刺足三里对APAP诱导或抑制肝药酶活性基本无影响。

表4 针刺足三里对APAP代谢过程中大鼠肝药酶活性的影响(±s)

表4 针刺足三里对APAP代谢过程中大鼠肝药酶活性的影响(±s)

注:与NC组比较:△P＜0.05，△△P＜0.01;与相应模型组比较:*P＜0.05，＊＊P＜0.01

组别 鼠数 Cyt．P450(μmol/mgprot) Cyt．b5(μmol/mgprot) NADPH-Cyt．C还原酶(nmol/mgprot)空白对照组(NC组)10 22.45±9.73 7.68±2.34 0.73±0.32模型L组(APAPL组) 10 19.05±7.54 8.11±3.04 0.66±0.21电针L组(AcupL组) 10 23.19±8.48 7.28±3.01 0.74±0.25模型M组(APAPM组) 10 19.33±7.41 7.35±3.37 0.71±0.37电针M组(AcupM组) 10 22.06±8.68 6.68±3.83 0.75±0.26模型H组(APAPH组) 10 20.52±7.82 8.25±2.70 0.68±0.31电针H组(AcupH组)10 21.36±8.99 7.59±2.46 0.74±0.26

4 讨论

文献报道显示，针刺足三里对毒物诱发的肝损伤具有保护作用［5-7］。而肝损伤与药物在体内的代谢和消除密切相关，因此研究针刺足三里对药物在体内代谢过程中酶学活性变化的影响对探讨其保护药源性肝损伤的作用机制具有重大意义。

GST属于Ⅱ相药物代谢酶，GSH为肝脏重要的解毒物质，GST催化外来化合物的中间代谢产物与GSH结合，在机体解毒和代谢过程中均起着非常重要的作用［8-9］。APAP剂量急剧增加时，代谢产生大量的N-乙酰对苯醌亚胺(NAPQI)诱发细胞膜系统脂质过氧化，导致肝细胞变形坏死［10-11］。当肝细胞受损时GST很快就会释放到血液中，且血液中GST的升高常常早于ALT和AST，因此GST的升高可以作为肝脏病理学改变的敏感指标［12］。笔者研究显示，随着APAP剂量急剧增大，血清中GST活性增大，但肝脏中GST活性降低，提示给予大剂量APAP后大鼠肝脏病理学发生改变，APAP可能诱发肝脏细胞损伤，解毒和代谢能力降低。而针刺足三里后，肝脏GST活性则进一步降低，提示针刺作用可能直接或间接地抑制肝脏GST活性，使其代谢能力减慢，APAP代谢减慢。这与笔者前期研究针刺足三里诱导APAP在大鼠体内清除率降低、代谢减慢的结果相一致［13］。

线粒体功能障碍是APAP肝毒性最重要的机制之一。完整线粒体暴露于含钙的NAPQI中会引起线粒体肿胀，线粒体膜流动性降低是APAP肝毒性的主要机制［14］。肝线粒体Na+-K+-ATP酶和Ca2+-Mg2+-ATP酶活性高低，直接或间接地影响肝脏细胞正常的解毒和代谢过程［15-16］。研究显示，针刺作用下，Ca2+-Mg2+-ATP酶活性明显减弱(P＜0.05)，针刺足三里可能诱导APAP加剧肝细胞线粒体钙代谢紊乱，导致肝线粒体功能障碍，减慢代谢APAP的过程。

SDH作为参与三羧酸循环最重要的脱氢酶，其活性变化可反映三羧酸循环状态和细胞能量代谢情况，是检测线粒体损伤程度的敏感指标［17］。针刺足三里可进一步抑制SDH活性，加重线粒体能量代谢障碍，且SDH活性与Na+-K+-ATP酶和Ca2+-Mg2+-ATP酶活性降低趋势基本一致，提示针刺足三里诱导APAP加重对能量代谢相关酶活性的抑制，减慢APAP在大鼠体内的转化和代谢过程。研究显示，针刺足三里增加APAP在大鼠体内的生物利用度，但减慢其清除速度［13］。因此，推测其可能与针刺足三里促进APAP体内血药浓度增大引起积蓄中毒进而加重线粒体能量代谢障碍、抑制能量代谢相关酶活性有关。

细胞色素 P450酶属于 I相代谢酶，包括Cyt P450和 Cytb5、NADPH-CytP450还原酶等。Cyt P450和Cytb5活性降低将直接或间接抑制肝脏对药物的代谢消除能力［18］。文献报道，当APAP诱导动物发生急性肝炎时，APAP诱导脂质过氧化及自由基的大量产生，引起CytP450水平下降［19］。研究结果表明，针刺足三里对APAP诱导或抑制肝药酶基本无影响，笔者推测其主要原因可能与APAP经肝药酶氧化代谢消除不是其主要代谢途径有关，而与针刺选择的穴位或针刺时间无关，针刺不通过抑制肝药酶而减慢APAP的代谢和消除。

综上所述，针刺足三里对肝药酶影响作用不明显，不通过抑制肝药酶途径减慢APAP的代谢和消除，但能诱导APAP加重对大鼠肝脏GST和能量代谢相关酶活性的抑制，减慢APAP的代谢和消除过程。至于针刺足三里诱导APAP代谢减慢是否促进APAP诱发肝损伤，有待于进一步的深入研究。

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EffectofAcupuncturingZusanliAcupointonDrugMetabolismCorrelated EnzymesinMetabolismofParacetamolinRats

MENGGuang-yi1，WANGDong-xiao2，PENGPing-zhi1，PANGJia-lian1，YANHao-lin1，YANGBin3△YANMing3
(1．TheFirstPeople'sHospitalofYulinCity，Yulin，Guangxi537000，China; 2．TheMaternalandChildHealth-CareHospitalofYulinCity，Yulin，Guangxi537000，China; 3．PharmacyCollege，GuangxiMedicalUniversity，Nanning，Guangxi530021，China)

Objective:ToinvestigatetheeffectsofacupuncturingZusanliacupointoncharacteristicsofrelatedenzymes inmetabolismofparacetamolinrats．Methods:70SDratswererandomizedinto7equalgroups，namelyAPAPLgroupand AcupLgroup，APAPMgroupandAcupMgroup，APAPHgroupandAcupHgroup，andthenormalcontrolgroup．Then sampleswerecollectedtotestdrugmetabolismcorrelatedenzymes．Results:ComparedtotheAPAPMgroupandAPAPHgroup，theactivatiesofGSTpromotedsignificantlyinserumanddecreasenotablelyinliverinAcupMgroupandAcupHgroup．ComparedtotheAPAPMgroupandAPAPHgroup，theactivitiesofNa+-K+-ATPase，Ca2+-Mg2+-ATPaseandSDH decreasedsignificantlyinAcupMgroupandAcupHgroup．AcupuncturingZusanlihadnosignificantinfluenceontheactivity ofCyt．P450，Cyt．b5andNADPH-cytochromeP450．Conclusion:AcupuncturingZusanlicancausetheinhibitoryactionto GSTandhepaticenergymetabolismenzymesduringthemetabolismofAPAP，buthasnosignignificantinfluenceonthe hepaticdrugmetabolismenzymesinrats．

Acupuncture;Zusanli;Paracetamol;GlutathioneS-transferase;Energymetabolismenzymes;Drug metabolismenzymes;Rat

R246

:B

:1006-3250(2015)08-0996-04

2015-02-26

广西自然科学基金资助项目(桂科自0991135)-针刺对对乙酰氨基酚所致肝损伤的保护作用机制研究

蒙光义(1983-)，男，广西灵山人，主管药师，医学硕士，从事临床药理学和药物毒理学的研究。

△通讯作者:杨 斌(1964-)，男，广西灵山人，教授，医学博士，硕士研究生导师，从事药物毒理学和中药药理学的研究，Tel:0771-5358272，E-mail:yangbin2003202@sina．com。