扶正祛邪方抗ConA模型小鼠肝损伤的凋亡机制

蔡庆春，朱平生

(1．河南中医学院第三附属医院，郑州 450008;2．河南中医学院，郑州 450008)

扶正祛邪方抗ConA模型小鼠肝损伤的凋亡机制

蔡庆春1，朱平生2△

(1．河南中医学院第三附属医院，郑州 450008;2．河南中医学院，郑州 450008)

目的:探讨扶正祛邪方对刀豆蛋白A(ConA)诱导小鼠急性肝损伤时肝细胞凋亡的影响及作用机制。方法:清洁级Balb/c雄性小鼠60只，体质量23～25g，按随机数字表法分为6组每组各10只。连续7d，每天1次，扶正祛邪方组分别按低(50.3g/kg)、中(67.0g/kg)、高(83.8g/kg)剂量给予小鼠灌胃扶正祛邪方溶液;阳性对照组灌服双环醇溶液(62.5mg/ kg);空白组和模型组灌服等体积生理盐水。于第7天末次给药2h后，除空白组外其余5组采用ConA(20mg/kg)尾静脉注射复制肝损伤动物模型，ConA注射6h后处死动物观测以下指标:小鼠一般状况、肝功能、免疫组织化学观测肝细胞凋亡指数。结果:一般状况模型组肝、脾明显瘀血肿大，肝、脾指数显著增高，高、中剂量FZ可明显减轻小鼠脏器指数及瘀血程度;高、中剂量FZ和双环醇均能显著降低模型小鼠的肝细胞凋亡指数;各给药组均能显著降低肝组织caspase-3表达水平，以高剂量FZ最优。结论:扶正祛邪方可通过减少caspase-3表达而起到抑制ConA模型小鼠肝细胞凋亡的作用，并具有较好的抗ConA模型肝损伤的效果。

刀豆蛋白A;扶正祛邪方;实验性肝损伤;细胞凋亡;小鼠

肝细胞凋亡是所有肝损伤疾病的主要途径［1］和重要原因［2］。既往研究发现，我院治疗自身免疫性肝病、病毒性肝炎等肝损伤的经验方扶正祛邪方可有效降低ConA模型小鼠血清ALT、AST活性［3］。为探讨该方抗肝损伤的保护作用，本研究对肝损伤的细胞凋亡机制进行了研究，现报告如下。

1 材料

1.1 实验动物

清洁级Balb/c雄性小鼠60只，体质量23～25 g，购自河南省实验动物中心(动物合格证号为SCXK(豫)2011-001)，河南省中医药研究院实验动物中心清洁区动物房饲养(自由饮食)、复制模型与观察。

1.2 药物及试剂

1.2.1 药物来源 所有药物购自河南省医药总公司，所用中药材均按《中华人民共和国药典》2010年版的规定采用道地药材，由河南中医学院生药学专家鉴定，保存样品备查，统一由河南中医学院制剂室一次制备后冷藏。

1.2.2 扶正祛邪方组成 西洋参10g，黄芪15g，白术10g，生薏苡仁30g，虎杖30g，土茯苓30 g，败酱草30g，赤芍30g，巴戟天10g，砂仁6g。

1.2.3 主要试剂 即用型快速免疫组化MaxVisionTM试剂盒，福州迈新生物技术开发有限公司(批号110812);原位细胞凋亡(TUNEL)检测试剂盒，武汉博士德生物工程有限公司(批号106005);caspase-3免疫组织化学一抗，武汉博士德公司(批号BA2142)。

1.3 主要设备

自动脱水机(ASP300)，德国Leica公司;包埋机(EG1160)，德国 Leica公司;轮转切片机(RM2035)，德国Leica公司;光学显微镜(BX40)，日本 Olympus公司;IX70OLYMPUS照相机; OlympusPM-30控制系统;HPIAS-1000高清晰彩色病理图文分析系统。

2 方法

2.1 设计方案

采用完全随机设计方案进行平行组对照。

2.2 动物分组

60只小鼠按随机数字表法分为正常对照组(1组)、模型组(2组)、双环醇组(3组)、低剂量扶正祛邪方组(简称低剂量FZ组，4组，下同)、中剂量FZ组(5组)、高剂量FZ组(6组)，每组10只。

2.3 给药方法

各组动物连续灌胃(0.25ml/10g)7d，每日1次。4、5、6组分别按低(50.3g/kg)、中(67.0g/ kg)、高(83.8g/kg)剂量灌服扶正祛邪方溶液，含生药量分别为2.0g/ml、2.7g/ml、3.4g/ml，相当于60kg成人临床用量的15、20、25倍;3组灌服双环醇溶液62.5mg/kg(2.5mg/ml)，相当于临床用量的25倍;1组和2组灌服等体积生理盐水。

2.4 模型复制

于实验第7天末次给药2h后(动物禁食16h，不禁水)，除1组外，其余5组动物采用ConA20 mg/kg尾静脉注射复制肝损伤动物模型［3］。ConA在临用前用无菌PBS稀释成2mg/ml注射，1组尾静脉注射同等量无菌PBS。注射ConA6h后处死动物，检测有关指标。

2.5 样品采集与处理

各组小鼠眼眦静脉取血，常温静置0.5h后，3000r/min离心15min，分离血清后备用;迅速摘取肝脏、脾脏称重，计算肝、脾指数;选取肝右侧最厚一叶，切取约1cm×0.5cm×0.2cm的肝组织2块，分别用10%的甲醛和4%的多聚甲醛固定，自动脱水机逐级酒精脱水，二甲苯透明，浸蜡、包埋、切片4 μm(所有载玻片预先用10%多聚-L-赖氨酸防脱片处理)。

2.6 原位末端标记凋亡细胞检测(TUNEL法)

用TUNEL法进行原位末端标记凋亡细胞检测;阳性细胞判断标准:细胞核中有棕色颗粒，胞核呈棕褐色者为凋亡细胞。计算5个高倍视野(×400)下的凋亡细胞数，凋亡指数以凋亡细胞/100个细胞表示。

2.7 免疫组织化学染色(Envision法)

免疫组化染色结果评估，光学显微镜下观察，阳性染色为棕黄色或棕褐色着色，背景呈紫蓝色。免疫组化图像半定量分析，应用HPIAS-1000高清晰彩色病理图文分析系统进行定量分析，每张切片随机均匀选取四周及中央5个高倍视野(10×40)，测定每个视野的积分光密度值(IOD)，IOD值越高表达越强。

3 统计学方法

采用SPSS13.0软件进行双侧检验，P值≤0.05为有统计学意义;数值变量以均数±标准差(±s)表示，分类变量采用频数(构成比)统计描述;对定量的各组样本均数比较采用F检验，各组样本均数用两两t检验。

4 结果

4.1 扶正祛邪方对ConA模型小鼠一般状况的影响

结果显示，6h内模型组和低剂量FZ组各有2只小鼠死亡，死亡率20%(2/10)。从各组一般状况和死亡率分析，模型组小鼠肝损伤严重，同时有暴发急性肝衰竭死亡的可能;高、中剂量FZ组可明显改善ConA模型小鼠的一般状况。经F检验，各组小鼠肝脏、脾脏指数的差异在α=0.05水准有统计学意义(P＜0.05)，提示扶正祛邪方对ConA诱导肝损伤小鼠升高脏器指数有降低作用。

4.2 扶正祛邪方对ConA模型小鼠肝细胞凋亡指数的影响

图1表1显示，凋亡的肝细胞多表现为胞膜完整、核改变，细胞核呈棕褐色着染或细胞浆因核DNA逸出而呈阳性着染，凋亡小体也呈阳性着色。1组偶见着色较弱的凋亡细胞，2组肝组织可见较多凋亡细胞，多分布于炎症坏死区及汇管区，各给药组凋亡细胞均有不同程度的减少且染色减弱。经F检验，各组小鼠肝细胞凋亡指数差异均在α=0.05水准有统计学意义(P＜0.05)，提示除低剂量FZ组外，各给药组均能显著降低ConA模型小鼠过度的肝细胞凋亡。

表2显示，肝细胞凋亡指数两两比较，1组与其他各组、2组与除4组外的其他各给药组、4组与其他各给药组两两间肝细胞凋亡指数比较差异在α= 0.05水准有统计学意义(P＜0.05)，提示高剂量FZ、中剂量FZ、双环醇均能显著降低肝细胞凋亡指数;其余两两组间比较差异均在α=0.05水准无统计学意义(P＞0.05)，表明高、中剂量FZ与双环醇间的效果比较差异无统计学意义。

图1 扶正祛邪方对ConA模型小鼠肝细胞凋亡的影响(×400)

表1 扶正祛邪方对ConA模型小鼠肝细胞凋亡指数的影响(±s，%)

表1 扶正祛邪方对ConA模型小鼠肝细胞凋亡指数的影响(±s，%)

注:F=98.40，ν组间=5，ν组内=274，P=0.000＜0.05

组别 剂量 例数 凋亡指数1组 —10 1.03±0.55 2组 — 8 18.82±5.28 3组 62.5mg/kg 10 12.49±4.94 4组 50.3g/kg 8 16.70±4.78 5组 67.0g/kg 10 11.65±4.77 6组83.8g/kg 10 9.96±3.62

表2 肝细胞凋亡指数的变化分析结果的两两比较

4.3扶正祛邪方对 ConA模型小鼠肝组织caspase-3表达的影响

图2表3显示，1组肝组织中caspase-3有少量表达，散在分布，阳性信号主要位于肝细胞胞浆内。2组caspase-3抗原阳性细胞明显增多，弥漫分布，在淋巴细胞浸润区周围较明显，胞浆和胞核均有表达。图像分析结果经F检验，各组小鼠肝组织caspase-3表达变化差异均在α=0.05水准有统计学意义(P＜0.05)，提示扶正祛邪方对ConA模型小鼠肝组织caspase-3的过度表达有显著降低作用。

表4显示，肝组织caspase-3表达变化的两两比较，1组与其他各组、2组与其他各组、4、5、6组之间以及3组与4组、6组两两间肝组织caspase-3表达变化比较差异在α=0.05水准有统计学意义(P＜0.05)，提示低、中、高剂量FZ，双环醇均能显著降低肝组织caspase-3表达水平;3组与5组组间比较差异在α=0.05水准无统计学意义(P＞0.05)，提示中剂量FZ与双环醇之间比较差异无统计学意义。

图2 扶正祛邪方对ConA模型小鼠肝组织caspase-3表达的影响(×400)

5 讨论

ConA模型小鼠产生肝脏损害的主要病理机制是肝细胞的大量凋亡。目前认为细胞凋亡是细胞在各种死亡信号刺激后发生的一系列瀑布式激活的主动性细胞死亡过程。对线虫(Caenorhabitis)的研究表明，Ced3基因的激活为线虫细胞凋亡所必需，其后在人类发现的与Ced基因高度同源的半胱氨酸天门冬氨酸蛋白酶 (cysteinylaspartatespecific proteinase，Caspase)家族［4］在诱导细胞凋亡的分子机制中起关键作用，是多条凋亡通路的汇聚点，也是执行凋亡的最终途径。

表3 各组小鼠肝组织caspase-3表达的变化(±s，IOD)

表3 各组小鼠肝组织caspase-3表达的变化(±s，IOD)

注:F=88.38，ν组间=5，ν组内=274，P=0.000＜0.05

组别 剂量 例数caspase-3 1组 —10 230±132 2组 — 8 4365±1784 3组 62.5mg/kg 10 2004±1039 4组 50.3g/kg 8 2907±1392 5组 67.0g/kg 10 1849±776 6组83.8g/kg 10 948±397

表4 各组小鼠肝组织caspase-3表达变化的两两比较

Caspase在细胞中以酶原(前体)方式存在，包含3个结构域，即氨基端的前结构域(prodomain)及大小两个亚单位。前结构域长的Caspase称上游Caspase，如Caspase2、Caspase8、Caspasel0;前结构域短的Caspase称下游Caspase，或效应Caspase，主要有Caspase3、Caspase6、Caspase7，由线粒体介导，Caspase-9驱动的凋亡内部途径和由死亡受体介导，Caspase-8、10驱动的凋亡外部途径在下游效应子的Caspase-3、7处会合。在凋亡执行阶段由下游效应子Caspase-3对特定的底物(多为一些关键酶)进行切割，激活核纤层蛋白、肌动蛋白等蛋白酶及核酸内切酶等，抑制DNA修复酶，从而破坏细胞骨架蛋白和核蛋白，使染色体断裂成小片断，这些不可逆转的改变导致细胞死亡［5-9］。

本实验中，我们通过原位末端标记凋亡细胞检测(TUNEL法)发现，与正常对照组比较，模型组小鼠肝细胞凋亡指数显著增高;而高、中剂量扶正祛邪方能有效减少模型小鼠的肝细胞凋亡，减轻肝脏损害，这与报道的Caspase抑制剂F1013通过抗凋亡机制作用于ConA诱导的小鼠急性肝损伤起到保护作用相一致［10］。实验结果显示，正常组小鼠肝组织中有少量caspase-3抗原表达，阳性信号主要位于肝细胞胞浆内。模型组caspase-3抗原阳性细胞明显增多，胞浆和胞核均有表达，与正常对照组比较差异有统计学意义;各剂量扶正祛邪方均具有抑制肝细胞凋亡、减少caspase-3表达的作用，与模型组比较，扶正祛邪方高、中、低剂量组以及双环醇组小鼠肝组织caspase-3的表达均有统计学意义，尤其以中剂量和高剂量组最为明显。这与扶正类中药方对肝损伤小鼠肝细胞凋亡影响的结果相同［11］。由此我们认为，扶正祛邪方可通过减少caspase-3表达而起到抑制ConA模型小鼠肝细胞凋亡、减轻肝组织损害的作用。

［1］ 赵钢德，谢青．对免疫反应介导的肝细胞损伤机制的新认识［J］．中华肝脏病杂志，2011，19(1):73-75．

［2］ 商红艳，欧启水．乙型肝炎病毒基因诊断进展［J］．国际检验医学杂志，2011，32(3):345-347．

［3］ 朱平生，王治英．扶正祛邪方对ConA诱导肝损伤模型小鼠的影响［J］．河南中医学院学报，2006，21(2):22-23．

［4］ MazumderS，PlescaD，AlmasanA．Caspase-3activationisa criticaldeterminantofgenotoxicstress-inducedapoptosis［J］．MethodsMolBiol，2008，414:13-21．

［5］ LarsenBD1，RampalliS，BurnsLE，etal．Caspase3/caspaseactivatedDNasepromotecelldifferentiationbyinducingDNA strandbreaks［J］．ProcNatlAcadSciUSA，2010，107(9): 4230-4235．

［6］ WolfBB，GreenDR．Suicidaltendencies:apoptoticcelldeathby caspasefamilyproteinases［J］．JBiolChem，1999，274(29): 20049-20052．

［7］ ViscontiR1，D＇AdamioL．Functionalcloningofgenesregulating apoptosisinneuronalcells［J］．MethodsMolBiol，2007，399: 125-131．

［8］ KuribayashiK，MayesPA，El-DeiryWS．Whatarecaspases3 and7doingupstreamofthemitochondria［J］?CancerBiolTher，2006，5(7):763-765．

［9］ LockshinRA．Programmedcelldeath:historyandfutureofa concept［J］．JSocBiol，2005，199(3):169-173．

［10］ 邓利娟，李湛军，罗楹，等．F1013对刀豆蛋白A致小鼠急性肝损伤的保护作用［J］．中国新药杂志，2014，23(10):1188-1193．

［11］ 周滔，闫秀川，陈倩，等．扶正化瘀方及其治法拆方对肝损伤小鼠肝细胞凋亡的干预作用［J］．中西医结合学报，2011，9 (1):57-64．

FuzhengQuxiePrescriptionResistancetoConAModelApoptosisMechanism ofLiverInjuryinMice

CAIQing-chun1，ZHUPing-sheng2△
(1．TheThirdAffiliatedHospitalofHenanUniversityofTCM450008，China; 2．HenanUniversityofTCM，Zhengzhou，Henan450008，China)

Objective:ToexploretheinfluenceandmechanismofFuzhengQuxiePrescriptiononthelivercellapoptosis inmicewithConcanavalinA(ConA)inducedacuteliverinjury．Methods:60Balb/cmalemiceweighing23to25gwere randomlydividedinto6groups，with10ineachgroup．ThesolutionofFuzhengQuxiePrescriptionwasgiventothemiceof highdosegroup(83.8g/kg)，mediumdosegroup(67.0g/kg)andlowdosegroup(50.3g/kg)respectivelythrough intragastricadministrationdailyandcontinuouslyfor7days．Thepositivecontrolgroupwasgivenbicyclolsolution(62.5 mg/kg)，andtheblankgroupandmodelgroupweregivenequalvolumeofnormalsaline．ConA(20mg/kg)wasgivento miceinallgroupsexcepttheblankcontrolviacaudalveininjection2hoursafterthefinaladministrationonthe7thday．SixhoursafterConAinjection，miceweresacrificedtoobservethegeneralcondition，liverfunction，thelivercellapoptosis indexbyimmunohistochemistry．Results:1．Generalcondition:obviouscongestionandtumescenceofliverandspleenwere foundinthemodelgroup，andtheindexofliverandspleenmarkedlyincreased;theorganindexandcongestioninthehigh doseandmediumdosegroupsmarkedlydecreased;Thelivercellapoptosisindexesinthehighdoseandmediumdose groupsandbicyclolsolutiongroupmarkedlydecreased;Theexpressionofcaspase-3declinedineachmedicatedgroupbut mostobviouslyinthehighdosegroup．Conclusion:1．FuzhengQuxiePrescriptioncanprohibitthelivercellapoptosisin ConAinducedmicebyreducingtheexpressionofcaspase-3.2．FuzhengQuxiePrescriptionhasgoodanti-injuryeffecton themicewithConAinducedliverinjury．

ConA;FuzhengQuxiePrescription;experimentalliverinjury;cellapoptosis;mice

R285．5

:B

:1006-3250(2015)08-0952-03

2015-01-02

△通讯作者:朱平生(1973-)，男，教授，医学博士，从事中医药防治肝胆病的临床与研究，E-mail:zhupingsheng@126．com。