肺纤维化动物模型的研究进展

杨晓燕，沈杰,2

1.上海中医药大学，上海 201203；2.上海市光华中西医结合医院，上海 200052

间质性肺炎是类风湿性关节炎常见的并发症，增加了类风湿性关节炎6%的死亡率[1]。目前关于类风湿性关节炎并发间质性肺炎缺乏疗效肯定的治疗方案。在探索类风湿性关节炎相关间质性肺疾病治疗的实验研究中，合适的动物模型是成功的重要条件。研究表明，类风湿性关节炎相关间质性肺疾病最常见的病理类型是普通型间质性肺炎（usual interstitial pneumonitis，UIP）[2-3]，在实验造模中常参考肺间质纤维化的动物模型。但仍缺乏特异性的，与类风湿性关节炎相关间质性肺炎发病机制及病理类型更接近的动物模型。在此，我们将就目前较常用的肺纤维化动物模型的建立方法进行简要总结。

1 博来霉素诱导肺纤维化动物模型

目前国际上应用最为广泛的就是博来霉素诱导肺纤维化动物模型。博来霉素是从轮枝链霉菌中提取的一种抗肿瘤药物，我国从放线菌菌株72号中分离出同样的抗生素。作为抗肿瘤药物，博来霉素应用于临床时常见的副作用是引起肺炎及肺纤维化症状，因而是肺纤维化动物模型最常用的诱导剂。在实验中常用的是日本生产的博来霉素，国内也有研究者采用国产的平阳霉素，平阳霉素是博来霉素的单体，其毒性较小。

1.1 动物品系的选择

刘蓉[4]等采用气管内注射博莱霉素的方法，比较BALB/c、C57BL/6及KM小鼠3种品系的肺纤维化的程度，光镜下观察各模型组肺组织均呈不同程度的纤维化，C57BL/6小鼠最明显；BALB/c小鼠肺纤维化模型组肺损伤程度及纤维化程度较轻，成功率仅70%；KM 小鼠肺纤维化程度介于二者之间，且有2只小鼠未出现肺纤维化。C57BL/6小鼠肺纤维化的程度较为理想。也有人比较了C57BL/6与ICR 小鼠2 种品系的造模效果，采用经尾静脉一次性注射博来霉素150 mg/kg 的方法诱导2 种种属的小鼠肺间质纤维化，结果C57BL/6 组小鼠出现明显的肺间质纤维化，ICR 组小鼠未见明显纤维化形成，2 组之间存在着明显的差异。说明C57BL/6 小鼠较ICR 小鼠更适于博来霉素诱导的肺纤维化动物模型[5]。国外研究中也多采用C57BL/6小鼠建立肺纤维化动物模型。C57BL/6小鼠是小鼠肺纤维化模型中最常用的小鼠品系。

大鼠也是肺纤维化模型常用动物[6]。至于品系，未见相关文献比较SD 大鼠与Wistar 大鼠在肺纤维化模型建立中的差异。国内实验研究中，2 种大鼠均常用于肺纤维化模型的建立[7-9]。

1.2 造模方法的选择

目前最常用的博来霉素诱导肺纤维化动物模型的方法是一次性气管内灌注。气管内灌注又分为直接灌注和间接灌注。直接灌注法是通过气管插管向动物气管内灌注博来霉素；间接灌注法是在动物颈部切口，钝性分离，找到气管后向气管内注入博来霉素。2 种方法在灌注后都需要将小鼠旋转，以便药物在肺部能够分布均匀，肺部纤维化程度均匀。李伟峰、王聪等使用MicroSprayere 雾化器（美国PENN-CENTURY）气管内雾化的方法建立动物模型，并与气管内滴注方法相比较，结果显示2种方法均能够引起肺纤维化，但气管内滴注组小鼠肺纤维化程度不一，病灶分布不均；而气管内雾化组小鼠肺纤维化病灶分布均匀，更适合用于小鼠肺纤维化模型[10-11]。国外研究者[12]也使用了这种雾化装置向大鼠气管内雾化博来霉素，诱导大鼠肺间质纤维化，降低了大鼠感染的风险，提高了造模成功率及肺内纤维化病灶分布的均匀程度。但这种装置价格较贵，成本高。周欢[13]使用同种微型雾化器气管内雾化建立肺纤维化动物模型，虽然复制出肺纤维化模型，但成功率及肺纤维化均匀程度并不高，且操作复杂。国内也有学者使用其他造模方法，如雾化吸入、经鼻滴注、尾静脉注射、腹腔注射等。刘珊[14]等比较了雾化吸入和气管内灌注方法建立的肺纤维化模型，认为雾化吸入法操作简便，吸入药物在肺内分布均匀，是一种较为理想实用的肺纤维化造模方法。该实验研究分别设置了雾化吸入2.5 g/L（0.25%）博来霉素稀释液15 min、1 h、2 h、6 h 组，实验结果显示15 min、1 h、2 h 组小鼠均无明显的肺纤维化，仅雾化6 h 组小鼠病理可见明显的肺纤维化，因此推断提高博来霉素浓度5 g/L（0.5%），并将雾化时间定为3 h可能获得理想的肺纤维化模型。但该推断并未获得证实，且5 g/L（0.5%）博来霉素雾化3 h需要消耗大量的博来霉素，提高了成本。尽管雾化吸入可以使小鼠肺纤维化分布均匀，但雾化吸入并不能确定每只小鼠吸入的博来霉素量，不能很好地控制小鼠的肺纤维化程度，且雾化时间过长，造模需要消耗大量时间。因此，雾化吸入在实验中的应用并不多。高占成[15]等在通过连续3 d 鼻滴入博来霉素的方法建立了肺纤维化动物模型，但胡静[16]等应用高占成的方法并未成功地建立模型，他们改良了这种造模方法，一次性鼻滴入博来霉素，建立了肺纤维化模型。不过，该实验并未设置气管内滴注组与鼻滴入法对照，虽然鼻滴入较气管内滴注操作简便，对小鼠损伤较小，但尚缺肺纤维化程度的比较。孟婕[17-18]等研究了连续多次尾静脉注射博来霉素造模的方法，并与气管内灌注法对比，两者均能成功地复制出肺纤维化模型，但尾静脉注射组病灶主要分布在胸膜下及血管周围，而气管内灌注组主要分布在支气管和细支气管周围，尾静脉注射组病灶的分布特点更接近于特发性肺纤维化，且尾静脉注射法小鼠病死率较低，但连续多次尾静脉注射操作不如一次性气管内灌注简便。杨聪颖、肖强[19-20]等通过对比不同剂量一次性尾静脉注射及多次尾静脉注射的造模方法，认为尾静脉单次注射博莱霉素200 mg/kg 可有效诱导肺纤维化，复制一个相对稳定的肺纤维化模型。这种方法相对于多次尾静脉注射方法简便得多，但用药剂量较大。此外，齐曼古丽·吾守尔[21]对比了腹腔注射与气管内灌注的方法，认为腹腔内给药法具有给药次数多、剂量大、制模时间长等缺点，但动物死亡率相对较低，且操作简便，病灶分布均匀。值得一提的是，以上经鼻滴入、尾静脉注射方法建立的模型均采用ICR 小鼠，可见小鼠品系的选择并不绝对，与造模方法有关。

1.3 药物剂量的选择

气管内灌注博来霉素诱导动物肺纤维化模型的方法虽然最常用，但博来霉素的用量国内外尚无统一标准。陶章[22]等分别用2、3.5、5 mg/kg 博来霉素造模，3 组均能成功地建立小鼠肺纤维化模型，但5 mg/kg组动物死亡率较其余2组高，综合考虑肺纤维化程度及小鼠的生存率，作者认为选取3.5 mg/kg博来霉素诱导小鼠肺纤维较为合适。鼻滴入、尾静脉注射、腹腔注射等方法因对动物损伤较小、死亡率低，尚未见关于这几种造模方法药物剂量选择的研究报道。

2 百草枯诱导肺纤维化动物模型

近年来，国内不少研究者使用百草枯诱导动物肺纤维化。百草枯为联吡啶类化合物，化学名为1，1-二甲基-4，4'-联吡啶鎓盐，是一种速效触杀除草剂。百草枯中毒的靶器官主要是肺脏，百草枯中毒后除急性死亡外，非急性死亡的病人多在15～30 d发生肺纤维化[23-24]。

2.1 动物品系的选择

使用百草枯诱导动物肺纤维化常选用的动物有小鼠、大鼠、家兔等。杨珊珊[25]等通过分别对KM、ICR及C57BL/6J小鼠腹腔注射百草枯溶液10 mg/kg或20 mg/kg 建立肺纤维化模型，28 d 后处死小鼠，在光学显微镜下发现KM 小鼠及ICR 小鼠肺组织均无明显纤维化改变，仅C57BL/6J小鼠部分区域有轻度纤维化形成。说明3 种小鼠中，C57BL/6J 小鼠更适合小鼠肺纤维化模型的建立。但该实验选用的是腹腔注射的造模方法，如果选用气管内灌注方法进行造模，也许结果不尽相同。关于动物品系的选择，C57BL/6J 小鼠是国内外应用较为广泛的品系，几乎适用于各种造模方法，但这并不能说明其他小鼠一定不能用来建立肺纤维化模型，这可能与造模方法有很大的关系，还需要更多的实验研究来证实。

2.2 造模方法的选择

使用百草枯建立肺纤维化模型，常见报道有一次性口服灌注、腹腔注射等造模方法。高燕[26]等选用KM小鼠，通过一次性灌胃百草枯100 mg/kg的方法建立肺纤维化模型，结果病理提示造模组肺组织3 d 时已出现严重炎性反应，21 d 时肺组织呈明显的纤维化改变。一次性口服灌胃方法操作简便，对动物损伤小，可用来进行肺纤维化的发病机理和药物疗效研究。尹江宁[27]也选用了一次性灌胃的方法建立了兔肺纤维化模型。杨珊珊[24]等选用一次性腹腔注射百草枯，尽管C57BL/6J小鼠组出现了肺纤维化，但程度轻，造模结果并不理想，可能与百草枯剂量过小有关。祝春青[28]等通过实验对比了一次性腹腔注射各剂量组的造模效果，结果各染毒组均出现不同程度的肺纤维化改变，且注射剂量越高，肺纤维化病变越严重，早期死亡率也越高。综合各方面考虑，一次性腹腔注射百草枯40～50 mg/kg 可制备较合适的小鼠肺纤维化模型。

3 其他

除上述较常用的博来霉素及百草枯造模方法以外，也有研究者采用盐酸模拟酸流吸入后对肺部造成的影响，观察盐酸（胃酸的主要成分）对肺部造成的损伤，建立肺纤维化模型[29]。有人选用气管内一次性注射携带TGF-β1 基因的腺病毒载体（AdTGFβ1223/225）诱导大鼠肺间质纤维化。腺病毒诱发的肺纤维化具有发病急、炎症反应强烈、细胞外基质增生迅速、胶原纤维弥散度高等特点，这些特点与特发性肺纤维化（idiopathic pulmonary fibrosis，IPF）病理过程极为相近，有望成为研究IPF 发病机制的可靠动物模型[30]。也有人选用金黄色葡萄球菌L 型致间质性肺炎的实验动物模型[31]，但该实验方法会造成小鼠多器官脏器发生间质性炎症改变，不适合间质性肺炎的动物模型。

目前国内外最常用、最受认可的肺纤维化模型仍是一次性气管内灌注博来霉素诱导的动物肺纤维化[32]。然而这种方法操作技术要求高，动物耐受差，死亡率高，造成的肺纤维化病灶分布不均匀，尚须改进方法，改善造模效果，提高动物生存率。国内研究中的其他造模方法，也需要更多的实验证明其可重复性、可靠性。总之，需要探寻一种操作更简便、更安全、可重复性高、肺纤维化分布更均匀、与肺纤维化临床及病理特点更相似的动物模型。

类风湿性关节炎相关间质性肺炎的发病机制尚不明确，研究表明可能与类风湿性关节炎患者免疫异常有关[33]。虽然类风湿性关节炎并发间质性肺炎的病理类型多为普通型间质性肺炎，这与我们常用的肺纤维化动物模型的病理类型相一致，但其发生机制与特发性肺间质纤维化可能存在差异。这就给类风湿性关节炎并发间质性肺炎的动物实验研究造成了困难。我们需要更多的研究来探索一种更贴近于类风湿性关节炎并发间质性肺炎临床特点的动物模型，以便于研究类风湿性关节炎并发间质性肺炎的发病机制及治疗方法。

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