基于脂肪干细胞的再生医学用于治疗糖尿病的研究

彭观球，佘妙琴，蔡祥胜

广东省惠东人民医院 急诊科，广东 惠东 516300

糖尿病是一种慢性疾病，在全球范围内影响超过3.47亿人[1-4]。由于高脂肪和高糖饮食以及久坐不动的生活方式，糖尿病发病率不断上升。此外，每年由糖尿病及其并发症造成的经济负担超出1000 亿美元。最常见的治疗Ⅰ型和一些Ⅱ型糖尿病的方法是胰岛素治疗。强化胰岛素治疗可以维持正常血糖，并控制急性低血糖症以及长期并发症[5]，但是不能达到正常的血红蛋白A1c水平。在血糖商业化监测方面，胰岛素制剂、胰岛素泵的进步也改进了对糖尿病症状[5]的控制。然而，即使采用广泛使用的胰岛素治疗，糖尿病患者的预期寿命平均比非糖尿病个体[6]约短12年。此外，那些Ⅰ型糖尿病发病的孩子，视网膜病变、肾病、神经性病变、各种心血管和外围血管疾病的风险增加显著[5-6]。

Ⅰ型糖尿病是由胰岛中的朗格尔汉斯细胞破坏能产生胰岛素的β细胞造成的自身免疫性疾病，治疗Ⅰ型糖尿病的更明确方案是胰腺或胰岛移植[8]。一个多世纪前，采用胰腺提取物在第一个糖尿病患者中进行了移植试验[9]。现代胰腺和胰岛移植可以比较有效地使空腹和餐后血糖水平、血红蛋白A1c水平及胰岛素和C-肽的生产恢复正常[6]。然而，严重缺少可用的捐赠者限制了这种治疗方法的推广[5]，只有0.5%的Ⅰ型糖尿病患者能从此受益[10]。此外，长期的免疫抑制和使用免疫抑制剂引起的副作用，如肾毒性、高血压和过敏感染，常常导致患者产生非医从性[5,10]。最后，对胰岛β细胞自身免疫的再次发生，仍然是一个主要的与移植疗法相关的挑战[6]。

干细胞分离和分化的最新进展已获得一种新的细胞系，这种细胞通过响应葡萄糖来合成、封装和分泌胰岛素。作为一种多能干细胞，胚胎干细胞（ES细胞）常向多种细胞谱系分化发育，导致目标细胞在混合细胞群中[6]。ES 细胞不含明确的内胚层标志物，而未分化的致畸ES 细胞也可造成严重风险[6,10]。由于道德和法律关注以及畸胎瘤形成的风险，胚胎干细胞进入临床仍然面临严峻挑战[11]。

现已知多潜能祖细胞定位于许多不同器官[12]。由于具有多能性，成体干细胞提供了一个比较可靠的来源间充质干细胞用于细胞疗法[13]。在众多组织来源的成体干细胞中，脂肪组织来源的干细胞（adipose-derived stem cells，ADSC）由于含有大量的干细胞和易于通过微创和相对便宜的方法获得，因而具有更大的吸引力[14]。骨髓和脂肪组织来源的间充质干细胞具有类似的细胞群和细胞特性[15]。据报道，在单位重量上脂肪组织比骨髓含有更大数量的间充质干细胞[3]。这篇综述主要介绍脂肪干细胞在治疗糖尿病和糖尿病并发症方面的进展。

1 直接分化成分泌胰岛素的β细胞

Kodama 等[16]提出了胰岛的4 种再生机制：①成熟的β细胞复制；②干细胞分化；③细胞融合；④干细胞转分化为另一种干细胞。大多数研究细胞为基础的治疗重点放在将干细胞直接分化成产生胰岛素的β细胞。

源自脂肪组织的间充质干细胞表现出适合转分化成胰腺内分泌谱系的独特的特点。新鲜分离的脂肪来源的干细胞也表达干细胞因子（SCF）及其受体（c-kit）[14]，但不表达ABCG2、巢蛋白、THY-1 和ISL-1。Lin 等[3]报道，脂肪干细胞组成型表达胰高血糖素、NEUROD及胰岛素。另外，增殖的脂肪干细胞表达转录因子ISL-1 和Pax-6，这是β细胞发育所需的关键转录因子[14]，先前的研究表明，在ISL-1 敲除小鼠的发育过程中胰岛素和胰高血糖素阳性细胞的形成受到抑制。脂肪干细胞增殖也表达干细胞标志物巢蛋白、ABCG2、SCF 和Thy-1。巢蛋白最初被认为是一种神经干/祖细胞标志物，但最近有报道认为这是一种在胰腺胰岛内的多能胰腺干细胞标志物[7]。ABCG2 还显示与胰岛衍生的前体细胞和神经干细胞相关[5]。Kojima 等[17]证实胰腺外产生胰岛素的细胞能表达胰岛素原和胰岛素，来源于由链脲霉素诱导的患糖尿病的啮齿动物的脂肪组织中。基于这些内在特征，脂肪干细胞分化后可以作为有前景的胰腺源激素生产细胞来源。

通过对关键步骤的胚胎发育和协调的激活期间细胞内转录因子的了解，使干细胞分化成为胰岛素生产细胞成为可能。像胚胎干细胞[18]，从ADSC分化成为胰岛素生产细胞是通过一个渐进多级分化方案进行的：从明确的内胚层到胰腺内胚层，最后成为胰腺激素表达细胞[2,14,19]。已有使用各种组合培养条件刺激脂肪干细胞成胰岛素产生细胞谱系的报道。

所有报告所述分化细胞群的染色阳性为双硫腙，表明存在内源性胰岛素。此外，这些干细胞来源的胰岛素分泌细胞大量表达PDX-1、C-肽、胰岛素、胰高血糖素、生长抑素、胰多肽及转运蛋白2[2,14]。已证实在分化的细胞中，ISL-1、Pax-4、NGN-3、IPF-1、Pax-6、NKX-2.2、NKX-6.1、FOXA2、GLP-1 受体和葡萄糖激酶增强表达，提示向胰腺谱系分化[2,7,14]。

将人类ADSC 衍生胰岛素产生细胞移植入经链脲佐菌素引起的糖尿病小鼠中后，检测到显著的人C-肽水平，证明体内成功地产生了胰岛素。虽然这些分化细胞表现出降低血糖水平的能力，但是与成熟的胰岛相比，其胰岛素分泌水平仍然较低，也未能使STZ诱导的糖尿病小鼠回复正常血糖[3,14,19]。

脂肪干细胞分化为胰岛素分泌细胞类似于成熟的自身胰腺细胞也仍然受到质疑。Dor 等[20]用遗传谱系追踪方法确定在成体中胰腺干细胞是否补充胰岛β细胞。在这项研究中，他们证明了在小鼠体内，末端分化成熟的β细胞维持其增殖能力，并作为新的β细胞的主要来源，与先前的报道相反[21]。虽然这项研究直接否定了在实施部分胰腺切除术后，多能成年干细胞取代β细胞在体内的作用；但它并不直接排斥体外分化成体干细胞后分化为产生胰岛素的细胞的应用，作为用于糖尿病的潜在新治疗选择，这已有许多研究报道。

2 移植胰岛的植入

胰岛移植的成功与否取决于将供体的胰岛移植到受体肝脏地方，通过肝门静脉输送。但是，细胞凋亡、炎症和缺血频繁干扰植入的成功[22]，因此，2个或2个以上的胰腺经常需要采购足够数量的胰岛来移植。考虑到供体器官严重短缺，这是限制这种疗法的主要原因。由于不可避免地破坏胰岛原生结构，其中包括胰岛内血管，分离期间，胰岛移植可能需要几个星期[23]。进一步恶化的胰岛和β细胞死亡可能是由于缺血和炎症，最终导致移植失败[24]。改善移植胰岛的植入会减少所需胰岛的数量，得到更积极的临床结果。

脂肪干细胞已被报道通过其分泌的营养因子而具有内在的再生血管生成的潜力和抗凋亡能力[25]。脂肪干细胞还具有抗炎和调节免疫的特性，包括抑制T 细胞增殖[8]。因此，ADSC 可以改善移植增强血管生成和抑制胰岛炎症。

Ohmura等[24]将肾包膜下的自体脂肪干细胞与同种异源小鼠胰岛共移植，自体小鼠脂肪干细胞能显著延长同种异体胰岛长达14 d，达到正常的血糖水平。单独移植胰岛不能存活超过2 d，也没有实现正常血糖。混合移植胰岛保存了完好的胰岛结构，且被内皮细胞包绕，提示血管生成改善。当脂肪干细胞联合移植供体胰岛细胞时，CD4+/CD8+T细胞的浸润和CD68的表达也明显减少，这意味着通过延长移植胰岛细胞的存活可调节抗炎和免疫作用[24]。虽然还不确定混合移植方法是否能成为临床工作模式，但利用肝门静脉胰岛移植而不是肾胶囊，在胰岛移植中使用ADSC有巨大的潜在益处。

Veriter 等[26]将灵长类动物的ADSC 和异种猪胰岛封装在半透膜胶囊中，并移植到灵长类动物体内。相比于单独封装胰岛，联合移植能改善氧合、移植物的存活和功能、糖化血红蛋白校正，并观察到包裹植入物内血管新生，从而减少移植后细胞应激[26]。

即使使用了免疫抑制，胰岛通过门静脉灌注到人体肝脏后在最初10～14 d 中大量丢失[27]；此外，据报道60%的移植胰岛在此期间死亡，即使是同种动物模型[28]。Ohmura[24]、Veriter[26]和Cavallari 等[29]证明，使用ADSC 能够防止早期移植死亡，对胰岛移植成功是非常有益的。

3 脂肪来源的干细胞在糖尿病治疗中的挑战和机遇

基于干细胞的细胞治疗糖尿病的几个不确定因素依然存在：①不存在黄金标准，可重复的用于从成体干细胞分化为产生胰岛素的细胞的方案；②精确量化干细胞衍生的β细胞逆转糖尿病的条件和在体外可以精确量化；③增殖能力和维持分化产生胰岛素的细胞；④敏感性反调节激素；⑤潜在的未分化的成体干细胞的不利作用；⑥潜在的体内分化的细胞植入后的迁移[4]。

一个主要的挑战还在于模仿生理胰岛素分泌的机制。胰岛素分泌通过复杂的监管体系，涉及多个激素反馈机制和神经刺激，包括胰岛内朗格尔汉斯细胞。例如，β细胞分泌胰岛素能抑制由α细胞分泌的高血糖素[30]，由δ细胞分泌的生长抑素也调节β细胞[31]分泌胰岛素。为了模仿正常或接近正常的代谢控制，分化细胞必须能够与现有的胰腺内分泌细胞相互作用。控制胰岛素释放的另一种机制是通过肠促胰岛素分泌激素，包括葡萄糖依赖性促胰岛素肽和胰高血糖素样肽[1,5,32]。这些肠道信号激素参与70%的葡萄糖诱导的餐后胰岛素分泌[32]。对这些信号作出反应的能力也是一个干细胞衍生的β细胞需要拥有的关键特性，从而更接近生理过程。最后，胰岛素分泌是搏动，而不是一个恒定的释放，并且这种搏动的作用是非常重要的[33]。干细胞分化成胰谱系，简单地产生胰岛素，即使具有葡萄糖反应的特性，却没有能力来适应这些复杂的相互作用，将无法扭转糖尿病症状。

天然胰岛的一般结构对于分化产生胰岛素的细胞的效率也是一个挑战。人体胰岛含有丰富的血管和神经，而体外培养时，干细胞来源的胰岛样结构迄今还没有表现出含有任何内在血管。β细胞和毛细管间的距离可潜在地影响胰岛素释放的动力学，非生理整合胰岛样结构可能会反过来影响植入、存活即植入物[34]的功效。β细胞释放胰岛素不仅受到增加的血糖水平影响，而且通过神经调节，大多期间通过膳食摄取[6]胆碱能神经元。即使整个器官或胰岛移植，由于缺乏神经支配，胰岛素分泌的头侧相的完全恢复将是失败的[35]。克服这些结构性难题至关重要，从而使干细胞衍生的β细胞或胰岛在未来临床上变为可行。

几乎所有从成体干细胞衍生的产生胰岛素的细胞共表达胰高血糖素、促生长素抑制素、胰多肽和胰岛素，这都是朗格尔汉斯未成熟胰岛的特点。这是一个不完整的分化干细胞，并且可能这些细胞是糖尿病动物无法回复正常血糖水平的一个主要原因还需要进一步的细胞分化和成熟，从而实现与正常相似的胰腺功能的替代。然而，有人还认为治疗糖尿病可能不需要终末分化成熟的β细胞。Konno等[36]和Kajiyama 等[37]报道了移植脂肪来源的干细胞过表达PDX-1能改善高血糖和提高成活率。此外，外生胰腺移植使血红蛋白A1c 水平正常化，并随后减轻或部分逆转由糖尿病引起的神经和肾脏的损害[5]实现血红蛋白A1c水平的正常也可能被证明是未来基于细胞疗法的关键。

糖尿病具有一个独特的不利于各种细胞类型的环境。据报道，从链脲霉素诱导的Ⅰ型和Ⅱ型糖尿病大鼠脂肪组织分离的间质干细胞增殖能力受到抑制[38]。如果脂肪干细胞植入后肢缺血模型之前是暴露于体外高葡萄糖浓度的，相比于在一个正常的葡萄糖浓度培养的细胞，其增殖能力和扭转下肢缺血的能力显著和不可逆地减少[38]。在Ⅰ型糖尿病患者中，自身免疫似乎没有从根本上影响胰岛和其祖细胞的再生能力[13]。Hess 等[39]表明，骨髓来源的干细胞通过刺激受者的先天胰腺细胞祖细胞和β细胞增殖来启动胰腺再生和逆转高血糖。脂肪干细胞极有可能具有同样的机制，需要进一步观察。使用脂肪干细胞提高胰岛的相对再生能力将可能使糖尿病患者受益。

从干细胞在体外分化为胰岛样细胞或胰腺样组织的移植可伴随移植排斥反应、移植肥厚、慢性低血糖和潜在恶性转化。共移植脂肪干细胞时，其内在免疫调节功能增强了多个类型植入组织的移植成功率[40]。Vanikar 等[40]报道，脂肪干细胞可能会减少肾移植时免疫抑制剂的需求量。减少所需的免疫抑制剂的用量，可以将这些试剂引起的并发症降到最低并改善胰岛移植临床结果。

大约90%的糖尿病患为Ⅱ型糖尿病。然而，由于Ⅰ型糖尿病一直是研究的前沿，只有少数基于干细胞的研究是用于治疗Ⅱ型糖尿病的[41]。相对于开发治疗Ⅱ型糖尿病的替代方法，使用从干细胞衍生的胰岛素分泌β细胞用于治疗Ⅰ型糖尿病似乎相对直截了当。对Ⅱ型糖尿病复杂的疾病机制和干细胞应用的关联的进一步研究，可以提高数以亿计的患者的生活质量。

4 结语

不可否认，脂肪干细胞应用于糖尿病的治疗是非常有前途的。丰富可用的组织来源，含量高和多能的脂肪间充质干细胞，其营养和再生能力，都可以为不断增加的糖尿病人群和相关的健康危机提供解决方案。理解脂肪干细胞及其发育的基础，对于糖尿病的治疗仍然被认为是在处于起步阶段，众多挑战和机遇仍在前面。从脂肪干细胞产生胰岛素的细胞，以及进一步向功能性胰岛产生的确切机理还需要深入探讨。可持续的分化成产生胰岛素的细胞仍在研究中。自身免疫攻击的β细胞，这是一个基本的Ⅰ型糖尿病的发病机制，还没有得到完全解决，并且可以使任何未来的基于细胞的治疗不可行。

目前采用胰岛素注射和胰岛移植治疗糖尿病都不是患者真正的最佳选择。干细胞在数量和多能性上为未来治疗数百万糖尿病患者提供了无限的理论上的可行性和希望。然而，如果所有的以干细胞为基础的治疗仅省去了葡萄糖监测和轻度改善糖尿病的症状，那么在未来就没有理由把这些疗法用于临床。因此，基于干细胞的治疗必须能够从根本上改善多方面代谢的控制，改善糖尿病患者的长期预后，才能被广泛接受作为一种临床上可行的疗法。

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