宫颈癌相关microRNAs表达调控机制的研究进展

赵皓琦，贺斌，王介东，刘书言，徐祥波＊

（1.国家人口计生委科学技术研究所生殖生理室，北京 100081；2.北京协和医学院研究生院，北京 100730；3 广西医科大学，南宁 530021）

宫颈癌是原发于子宫颈的恶性肿瘤，因其高致死率已成为世界范围内危害女性健康的三大妇科肿瘤之一［1-2］。近60年以来，由于阴道细胞学检查的广泛应用，大大提高了宫颈癌的诊断水平，其发病率在发达国家有所下降。然而，宫颈癌年轻化的趋势日益明显，且中晚期宫颈癌的致死率仍高居不下。因此，对宫颈癌发生发展的机制研究特别是宫颈癌的年轻化发病机制仍有待深入。

microRNAs（miRNAs）是一类内源性非编码蛋白的、长度约为18～25个核苷酸的小RNA。它们来源于具有发夹样结构的转录体，通过与靶mRNA结合，启动其降解和／或翻译抑制，进而参与调控细胞的增殖、分化和凋亡［3-4］。肿瘤的发生发展是一个多因素、多阶段的发展过程，肿瘤中的miRNAs具有抑癌型和致癌型两种类型。在特定的肿瘤类型中究竟是哪一种miRNAs发挥功效，取决于特定的基因或通路［5］。miRNAs的异常表达对宫颈癌的发生发展、转移、临床分型、耐药性以及预后不良具有重要的影响，然而miRNAs在肿瘤中异常表达调控机制的研究相对较少，而对其上游调节机制的认识是理解miRNAs在肿瘤中异常表达的根本所在，将有助于理解肿瘤发生发展机制以及为治疗提供策略。因此，本文将对宫颈癌中miRNAs上游调控机制的现状进行阐述。

一、miRNAs简介

miRNAs主要定位在人类1号、14号、17号、19号和X 染色体上，在染色体中集中分布于3’非转录区（3’UTR）、基因间区域、内含子、外显子以及非蛋白编码区［6］。而在宫颈癌中，大多数的miRNAs位于内含子区域，极少数分布在3’UTR［7］，是由RNA聚合酶II产生的具有茎环结构及5’帽子和poly（A）尾 巴 的pri-miRNA 转 录 而 来［8］。在pri-miRNAs的转录过程中，会被细胞核RNA 聚合酶III Drosha裂解为miRNAs前体（pre-miRNAs），随后pre-miRNAs经另一种RNA 聚合酶III Dicer的加工处理，最终形成成熟的miRNAs［2］。miRNAs可以通过碱基互补配对原则，与mRNA 的3’UTR 互补位点靶向结合，从而起到负向调控基因表达的功能。miRNAs与mRNA 的特异性结合能够引起转录抑制和外切体mRNA 降解。实验证据显示，单个miRNA 平均可以抑制上百个mRNAs［9］。作为参与转录后调节的重要因子，miRNAs在真核生物各种生命活动过程中发挥着重要作用。

二、miRNAs的表观遗传修饰

异常的表观遗传改变是肿瘤细胞中比较常见的现象，如基因组DNA 的甲基化修饰异常、组蛋白修饰的改变和基因组印记等。研究表明，相当数量的miRNAs受到表观遗传的调控。一些miRNAs的表观遗传改变是引起宫颈癌癌变的重要因素。其中，表观遗传修饰对miRNA 表达的调节作用被认为是宫颈癌中miRNA 调节失控的主要原因之一，主要包括甲基化和组蛋白修饰［9］。

1.甲基化修饰与miRNAs：近年的研究显示，miRNA 启动子区域的甲基化修饰与宫颈癌之间存在着紧密的联系，其异常甲基化修饰也是肿瘤表观遗传学的研究热点。主要表现为抑癌型miRNAs的表达水平与其启动子区域甲基化水平呈现负相关性，而致癌型miRNAs启动子区域的低甲基化状态与肿瘤的进展相关［10］。

宫颈癌发生和发展是一个非常复杂的病变过程，一般是由宫颈上皮不典型性增生到原位癌再到宫颈浸润癌的发展构成的。根据宫颈上皮不典型性增生程度和范围的不同，上皮内瘤变又分为CIN 1、CIN 2 和CIN 3。CIN1 极 少 转 变 为 癌，CIN2 和CIN3有癌变的可能，由CIN1到CIN3病变等级逐渐加深。甲基化的miR-203和miR-375在CIN3组织和宫颈鳞状细胞癌组织中表达显著高于CIN1和癌旁组织组织［11］。而在宫颈癌细胞系中，临近miR-203和miR-375启动子区域的CpG 岛表现出明显的超甲基化。如利用去甲基化因子处理细胞系后，这两种miRNAs的表达又趋于增加，表明甲基化修饰可以改变抑癌型miRNAs抑制肿瘤的作用。同样，宫颈癌中抑癌型miRNAs（miR-124a、miR-34b和miR-203）表现为高甲基化状态［12］，它们的高甲基化程度与宫颈癌的高风险性密切相关。这些结果提示由甲基化异常引起的miRNAs表达改变与宫颈癌的发生发展有着紧密的关联。

2.组蛋白修饰与miRNAs：翻译后修饰在蛋白质加工、成熟的过程中发挥着重要的作用，它可以改变蛋白质的物理、化学性质，影响蛋白质的空间构象及活性位点的暴露，进而影响蛋白质的生物活性。组蛋白的乙酰化、磷酸化、糖基化等共价修饰则可以使染色质的活性发生变化，从而起到调控基因转录的作用。

当前与调节miRNAs的表达相关的组蛋白修饰主要集中于组蛋白的乙酰化和去乙酰化，对其它的翻译修后饰研究相对较少。乙酰化的组蛋白可以使DNA 与组蛋白解离，核小体结构松弛，是调控基因活性的一个关键步骤。在宫颈癌、卵巢癌及乳腺癌中已有研究表明，抑制型组蛋白会导致抑癌型miRNAs 的基因沉默，其共价修饰标记物H3K9me3和H3K27me3 的高表达伴随着抑癌型miRNA miR125b1基因的沉默［13］。对宫颈癌细胞系的研究［14］表明，当细胞经组蛋白去乙酰化酶（HDAC）抑制剂处理后，pri-miR-214表达下调，而成熟型miR-214则表达上调。此外，HDAC 的处理后，miR-214 的 靶 基 因Bcl212、MEK3、JNK1 和Plexin-B1的表达显著降低。除宫颈癌外，其它肿瘤中也广泛存在组蛋白修饰调控miRNAs表达的现象。MHC-I 类链相关蛋白A（MHC classⅠchain-related A，MICA）是一种在肿瘤免疫监视中起非常重要作用的蛋白。肝细胞癌中组蛋白去乙酰酶抑制剂（HDIs）通过调控miR-17-92基因簇和微小染色体维持蛋白7（MCM7）可以上调MICA 的表达，从而增加由自然杀伤细胞所介导的肝细胞癌溶解的敏感性［15］。同样在miR-17-92基因簇的研究中，三种HDIs均可降低该miRNAs基因簇的表达，并伴随着基因簇靶基因表达的升高，miR-17-92的低表达可能部分缘于HDIs的抗增殖效应［16］。慢性淋巴细胞白血病中，HDAC 呈现出高表达趋势，同时该酶能够介导抑癌型miR-15a，miR-16和miR-29b的沉默，而当HDAC 被抑制后，这些miRNAs的表达又得到了恢复［17］。组蛋白去乙酰化酶抑制剂SAHA 则能够上调miR-200b，同时可以降低miR-146b的表达［18］，而这两种miRNAs的靶基因所编码的蛋白在蛋白酶体构成及泛素化降解中扮演着重要的角色。由此可见，在宫颈癌及其它癌症中，组蛋白修饰，特别是由组蛋白去乙酰化酶及其乙酰化酶抑制剂所介导的修饰作用是除甲基化修饰以外，通过表观遗传修饰调控miRNAs表达的又一关键机制。

三、人乳头瘤病毒（HPV）与miRNAs

HPV 与宫颈癌的发生发展密不可分。该病毒可以通过靶向失活宿主的抑癌基因影响细胞进程，使细胞凋亡、细胞周期调控、迁移以及免疫逃逸等肿瘤发生发展的重要关键过程失控。

现有大量证据表明，HPV 病毒所合成的蛋白与miRNAs之间有着紧密的联系。miRNA 表达谱分析是miRNA 研究中的重要一环，利用miRNA 芯片联合小RNA 测序技术可以高通量地进行表达谱筛选。利用该技术对包皮和阴道角化细胞中HPV16和HPV18 与miRNAs的分析显示，miR-16、miR-25、miR-92a和miR-378显著上调，而miR-22、miR-27a、miR-29a和miR-100 则显著下调。这些miRNAs表达水平上的差异可能是由病毒蛋白E6、E7单独或同时调控所导致［19-20］。在转染有HPV16E5的人类角化细胞中，E5的高表达能够下调miR-203和miR-324-5，同时上调miR-146a［21］。Au 等［22］研究发现，miR-23b在HPV 相关的宫颈癌中通常表现为低表达，它的靶标——尿激酶型纤溶酶激活因子（uPA）却可在宫颈癌而非正常宫颈组织中被检测到。HPV16E6 癌蛋白可以降低miR-23b 的表达并上调uPA，进而诱导宫颈癌细胞的迁移能力。

HPV 除了对miRNAs表达的直接调控作用外，还可能参与甲基化修饰。HPV 的类型与甲基化修饰密切相关。CaSki、HeLa、SiHa和C33A 是宫颈癌研究中常用的细胞系。miR-432、miR-1286、miR-641、miR-1290、miR-1287和miR-95的超甲基化现象存在于多种宫颈癌细胞系中。将这些细胞经去甲基化药物处理后，miRNAs的高表达存在于CaSki、HeLa、SiHa这三种与HPV 感染有关的细胞系中，而未被HPV 感染的细胞系C33A 则无此情况［10］；Wilting 等［11］发 现miR-149、miR-203、miR-375和miR-638的启动子区域明显的高甲基化与HPV16和HPV18关系密切。

四、miRNAs海绵与miRNAs

在某些条件下，一些基因可能是miRNAs连接位点的真实靶标，但在其它条件下这些基因可能会作 为 miRNAs 的 假 基 因［9］，又 称 海 绵 调 控 子（Sponge Modulators）或miRNAs海绵。miRNAs海绵由开放阅读框（ORF）和含有miRNAs作用元件（MREs）的3，非翻译区（3，UTR）组成，其中的MREs可以与多种miRNAs结合［23］。这种结合可以特异性地降低miRNAs的数量，从而抑制miRNAs发挥作用［24］。

在子宫内膜癌干细胞中，基因间长链非编码RNA-RoR（linc-RoR）可以发挥miRNAs海绵的功效，抑制miR-145所引起的肿瘤干细胞球分化［25］。对于宫颈癌而言，miRNAs海绵同样发挥着重要的作用。研究表明，八聚体结合转录因子4（Oct4）能够上调miR-125b的表达，间接抑制宫颈癌细胞的凋亡和BAK1蛋白的表达，而miRNAs海绵能够结合miR-125，使OCT4 对miR-125b 的作用得到抑制，抗凋亡能力受到破坏、BAK1 的表达得到恢复［26］。

在研究中，通过人工技术所合成的miRNAs海绵往往作为“诱饵”来有效地抑制miRNAs的功能，因而在肿瘤小分子RNA 的相关领域中得到了广泛的应用。在膀胱癌的研究中，Yang等［27］发现高表达的miR-21伴随着代谢相关基因的表达，利用慢病毒介导的miR-21 海绵通过敲低miR-21 的表达能够降低糖酵解相关调控基因的表达，进而有效地抑制肿瘤细胞的糖酵解。人工合成的miRNAs海绵能够用来敲降过表达的致癌型miRNAs，为肿瘤的靶向治疗提供了又一行之有效的方法。此外，它也能够用于阻断抑癌型miRNAs，为解密miRNAs在癌症发生过程中的作用提供新的途径。

五、miRNAs多态性及其调控

miRNAs多态性与其调控关系密切。miRNAs分为前期miRNAs（pri-miRNAs）、前体miRNAs（pre-miRNAs）和成熟miRNAs三种。这些miRNAs及其与靶基因结合的位点上所呈现的单核苷酸多态性（SNP）可能参与调节miRNAs的结合亲和性、改变靶基因的表达水平，进而增加癌症的易感性［28-29］。近年来有研究表明，miRNAs相关的、位于miRNAs自身或连接位点上的单核苷酸多态性（SNPs），能够显著改变miRNAs 的产生和／或功能，进一步增加罹患癌症的风险。

在对中国宫颈癌患者的研究中表明，pri-miR-218（rs11134527）的改变能够调节miR-218的表达，这一多态性可能作为功能性的SNP，通过调节miRNAs的连接过程影响宫颈癌的发生［29］。Yue等［30］研究认为miR-146a（rs2910164）的多态性在中国人群中同样与高风险性宫颈癌密切相关。另一项以亚洲患者为对象的研究［31］中发现，存在3 种miRNA多态即miR-146aG＞C（rs2910164）、miR-196a2C＞T（rs11614913）以及miR-499A＞G（rs3746444）。

其中，rs2910164 中C 等位基因与癌症的低风险性相关。亚组分析显示，中国患者中rs2910164C等位基因的降低与宫颈癌、肝细胞癌和前列腺癌关系密切。rs11614913多态性分析表明，TT 基因型与癌症的低风险性有关，而rs3746444的G 等位基因则与之相反。Zhou 等［32］在宫颈鳞状细胞癌（CSCC）pre-miRs多态性的研究中发现，rs3746444和rs2910164的G 等位基因与高风险性的CSCC密切相关。Mi等［33］认为，miR-135b 结合位点上，当rs1131445中T 被C 取代后会损伤miR-135b与其作用靶点IL-16的结合，导致宫颈癌患病率的提高。在对宫颈癌中常见的三种SNPs（pri-miR-26a-1 rs7372209、pre-miR-27ars895819 和pri-miR-100 rs1834306）进 行 研 究 时 发 现，pre-miR-27a 中rs895819多态性呈现出显著的宫颈癌相关性，其T等位基因、CT 或TT 基因型与宫颈癌的低风险性有关［34］。

综上所述，随着小RNA 新一代测序技术和miRNAs表达谱芯片等多种检测方法的进步，现已在宫颈癌中筛选到多种差异表达的miRNAs，并对其中一些miRNAs的功能进行了验证，证实miRNAs的异常表达与宫颈癌的发生发展密切相关。一个miRNA 可能有多个靶基因，而一个基因也可能受多个miRNAs的调控。相比较miRNAs对宫颈癌发生发展起重要调节作用的丰富研究成果，上游对miRNAs的调控机制的研究却仍十分有限，因此探索导致miRNA 表达改变的原因十分重要，这不仅有助于理解宫颈癌的发生发展机理，更为寻找高特异性的早期诊断标志物、有效的药物新靶标和宫颈癌个体化治疗提供新的思路。

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