新疆传统乳品中乳酸菌的抗氧化能力*

蒋琰洁，李宝坤，李开雄，卢士玲，王庆玲，蒋彩虹，樊哲新，朱敏

(石河子大学食品学院，新疆石河子，832000)

乳酸菌具有抗癌、降低胆固醇、增强免疫力、治疗慢性尿道感染以及延缓衰老等功效［1］，这主要是由乳酸菌的抗氧化这一特性发挥作用。乳酸菌的抗氧化活性已经通过体外和体内实验得到证实［3］，人们对于功能性食品和含有益生菌的乳制品的使用越来越感兴趣，他们在胃肠道疾病的预防及治疗方面都有涉及。因而，乳酸菌势必成为人们首选的新型抗氧化剂。

本文从酸奶和干酪中初步分离得到24株乳酸菌菌株，通过过氧化氢耐受性实验初步筛选获得7株高耐受性的菌株。在此基础上，对乳酸菌的无细胞提取物及细胞菌悬液的抗氧化性能进行比较研究，旨在为乳酸菌抗氧化剂的应用提供依据和参考。

1 材料与方法

1.1 材料与试剂

1.1.1 菌株的活化与培养基

乳酸片球菌(Pediococcus acidilactici)、植物乳杆菌(Lactobacillus plantarum)、耐久肠球菌(Enterococcus durans)、魏斯氏菌(Weissella cibaria)和面包乳杆菌(Lactobacillus panis)为实验室保藏菌株。

将7株已纯化的乳酸菌菌株样品分别接种于MRS培养基中，置于37℃培养箱中活化培养24 h，连续传代2次，然后划线接种于固体MRS培养基中培养48 h。

MRS培养基:蛋白胨10 g、牛肉膏10 g、酵母膏5 g、葡萄糖 20 g、MgSO40.58 g、柠檬酸氢二铵 2 g、K2HPO42 g、乙酸钠5 g、MnSO40.25 g、吐温1 mL，去离子水1 000 mL，pH6.2 ～6.6，121 ℃灭菌20 min。

1.1.2 试剂

二苯代苦味肼基自由基(DPPH)、三氯乙酸(TCA)、过氧化氢、O-菲罗啉、FeSO4、铁氰化钾、FeCl3、甲醇，为国产分析纯试剂 北京奥博星生物技术有限公司。

1.2 仪器与设备

722可见光分光光度计，北京精密科学有限公司;Neofuge台式高速冷冻离心机，力康发展有限公司;BS2000S电子天平，北京赛多利斯天平有限公司;MA110电子分析天平，上海第三天平仪器厂;DNP-9272生化培养箱，上海精密试验设备有限公司;LDZX-40灭菌锅，上海申安医疗器械厂;HI8424NEW酸度计，北京哈纳科仪科技有限公司;KQ-200VDE双频数控超声波清洗器，昆山市超声仪器有限公司;DK-8D恒温水浴锅，金坛市医疗器械厂;超净工作台，上海博迅实业有限公司医疗设备厂。

1.3 实验方法

1.3.1 乳酸菌的培养及无细胞提取物的制备

菌株以MRS培养基在37℃培养24 h，传3代后，培养液5 000×g离心15 min，收集菌体。用无菌PBS缓冲液洗涤后重悬，调整菌数至109/mL。将所得悬液分为2组:活细胞组(IC)和无细胞提取物的制备组。将菌悬液冰浴超声波破碎，4℃ 10 000×g离心20min，收集上清液，即为无细胞提取物(CFE)。

1.3.2 清除羟自由基实验

在试管中依次加入O-菲罗琳(2.5 mmol/L)、磷酸缓冲液(0.02 mol/L，pH=7.4)、蒸馏水各1 mL，充分混匀后加入FeSO4(2.5mmol/L)1 mL，混匀再加入H2O2(0.01%)1 mL，37℃水浴1 h后在536 nm处测其吸光度为A1;用1 mL蒸馏水代替1 mL H2O2为A0;用1 mL样品代替1 mL蒸馏水为As［4-6］。

1.3.3 清除DPPH自由基实验

1 mL样品加入1 mL DPPH甲醇溶液(0.2 mmol/L)，放置室温下暗反应30 min后，在517 nm处测吸光度，以磷酸缓冲液作为空白对照［7-10］。

1.3.4 清除超氧阴离子实验

将0.1 mL样品加入4.5 mL Tris-HCl缓冲液(pH=8.0)，25℃水浴预热20 min后，加入0.4 mL 25 mmol/L的邻苯三酚，于25℃水浴反应5 min，立即滴入2滴8 mol/L的HCl终止反应，在325 nm处测定吸光度，用蒸馏水调零。空白组用0.1 mL H2O代替样品即为A0［11］。

1.3.5 还原能力测定

在0.5 mL待测样品中加入0.5 mL磷酸缓冲液(0.2mol/L，pH=6.6)及0.5 mL铁氰化钾(质量分数为1%)，混匀后于50℃水浴20 min，反应后急速冷却。再加入0.5 mL三氯乙酸(质量分数为10%)，4 000×g离心10 min，取1 mL上清液，加入蒸馏水和FeCl3(质量分数为0.1%)各1 mL，混匀后静置10 min。在700 nm处测定吸光度，吸光度越大代表样品的还原能力越强［12］。

1.3.6 亚铁离子螯合能力测定

在试管中依次加入0.1 mL抗坏血酸(质量分数1%)，0.1 mL FeSO4(质量分数0.4%)，1 mL 0.2mol/L NaOH混匀后，混合液中加入0.5 mL待测样品，于37℃水浴20 min后，三氯乙酸沉淀蛋白3 000×g离心10 min，取0.2 mL上清液加入2 mL O-菲罗琳(质量分数0.1%)，10 min后在510 nm处测定吸光度，以磷酸缓冲液作为空白对照［13，14］。

2 结果与分析

2.1 清除羟自由基实验结果

生命体在代谢的过程中会产生许多自由基，其中羟自由基活性最强，因而氧化能力也极强。所以，本文主要研究乳酸菌对羟自由基的清除能力以确定其抗氧化效果。

由图1、图2可知，7株乳酸菌都存在一定的羟自由基清除能力，面包乳杆菌的完整细胞液和无细胞提取物的羟自由基清除能力均为最强，和其余几株乳酸菌相比差异显著(P＜0.05)。无细胞提取物的羟自由基清除能力与完整细胞液相比要弱很多。因而，乳酸菌清除羟自由基的活性物质主要存在于菌体表面和代谢产物中，而不是细胞内。另外，不同的乳酸菌具有不同的羟自由基清除能力，同种乳酸菌12-4、15和24-7之间的羟自由基清除能力差异并不显著，这可能是不同乳酸菌所含活性物质不同所决定的。

2.2 清除DPPH自由基实验结果

DPPH紫外分光测定法是一种常见的用来评价和筛选待测样抗氧化效果的有效方法，常用来评价和检测待测物的抗氧化能力［15］。在本实验中加入了乳酸菌的完整细胞或无细胞提取物，通过对检测乳酸菌对DPPH自由基清除能力的高低可以显示出其抗氧化能力的强弱。

由图3和图4可知，7株乳酸菌的完整细胞液和无细胞提取物并不全具有一定的DPPH自由基清除能力，其中2-5的完整细胞液和无细胞提取物均不具有DPPH自由基清除能力，19-10的完整细胞液不具有DPPH自由基清除能力，其余菌株的清除力差异显著。乳酸片球菌完整细胞液的DPPH自由基清除能力最强，与其余菌株相比差异显著(P＜0.05);植物乳杆菌12-4无细胞提取物的DPPH自由基清除能力最强，与其余菌株相比差异显著(P＜0.05)。其中乳酸片球菌完整细胞液的DPPH自由基清除能力要明显高于其他菌株，无细胞提取物的DPPH自由基清除能力要明显低于其他菌株，说明菌株清除DPPH自由基的活性物质存在于不同的细胞部位。综合来看，魏斯氏菌的DPPH自由基清除能力相对较强。

2.3 清除超氧阴离子实验结果

超氧阴离子自由基虽然不能直接与生物和食品体系中的脂类发生氧化反应，但它可以在金属离子的催化作用下发生芬顿反应，产生活性较高的羟自由基。一般此种方法常用来测定乳酸菌清除超氧阴离子自由基的能力。LIU等［16］研究发现，人体在摄入某些乳酸菌后不仅可以降低活性氧的积累，还能降低超氧阴离子和过氧化氢的浓度。

由图5和图6可知，以上7株乳酸菌的完整细胞液和无细胞提取物均具有一定的超氧阴离子清除能力，完整细胞液组中的乳酸片球菌的超氧阴离子清除能力最强，与其余6株乳酸菌相比差异显著(P＜0.05);无细胞提取物组中的植物乳杆菌15的超氧阴离子清除能力最强，与其余6种乳酸菌相比差异显著(P＜0.05)。比较完整细胞组及无细胞提取物组，发现各菌株的完整细胞液对超氧阴离子的清除能力均高于无细胞提取物。实验表明，乳酸菌清除超氧阴离子的活性物质大部分存在于细胞外。由实验可以得出，在7株乳酸菌中乳酸片球菌和植物乳杆菌15的超氧阴离子清除能力较强。

2.4 还原能力测定结果

研究表明，一种物质的还原能力可以作为它是否具有抗氧化活性的重要指标［17-19］。还原能力，是指一些酶和非酶复合物具有减少氧自由基和螯合亚铁离子的能力，从而减少氧化反应的发生。

由表2可知，7株乳酸菌均表现一定的还原能力，其中面包乳杆菌的还原能力最强，与其余6株乳酸菌相比还原能力差异显著(P＜0.05);同种乳酸菌12-4、15和24-7之间的羟自由基清除能力差异并不显著;无细胞提取物中并未检测出任何还原能力。实验表明，乳酸菌具有还原能力的活性物质均存在与细胞表面或代谢产物中，而并不存在于胞内提取物中。

2.5 亚铁离子螯合能力测定结果

由图7和图8可知，以上7株乳酸菌除了魏斯氏菌的无细胞提取物外，其余6株菌的完整细胞液和无细胞提取物都具有亚铁离子螯合能力，完整细胞液组中的植物乳杆菌15的亚铁离子螯合能力最强，螯合率高达56.97%，与其余6种乳酸菌相比差异显著(P＜0.05);无细胞提取物组中的植物乳杆菌24-7的亚铁离子螯合能力最强，与其余6种乳酸菌相比差异显著(P＜0.05)。比较完整细胞组及无细胞提取物组，发现各菌株的完整细胞液对亚铁离子的螯合能力均高于无细胞提取物。实验表明，乳酸菌亚铁离子螯合的活性物质大部分存在于细胞外。在7株乳酸菌中，植物乳杆菌15和24-7的亚铁离子螯合能力较强，这与Lee等［21］研究发现乳酸菌的抗氧化效果是通过螯合铜离子和亚铁离子来实现是一致的。

3 结论

研究发现乳酸片球菌、魏斯氏菌、面包乳杆菌、植物乳杆菌和耐久肠球菌都具有一定的抗氧化活性，但彼此差异较大，即使是同一种乳酸菌如植物乳杆菌，也存在较大差异。其中，面包乳杆菌的羟自由基清除能力和还原能力最强，魏斯氏菌的DPPH清除能力相对较强，植物乳杆菌的超氧阴离子清除出能力和亚铁离子螯合能力相对较高。。

通过研究还发现，不同乳酸菌的抗氧化能力不同且差异较大，可能是因为具有抗氧化能力的活性物质种类或浓度不同;另外，同一种乳酸菌的完整细胞液和无细胞提取物的抗氧化能力也不同，这可能是具有抗氧化能力的活性物质存在于不同的细胞部位导致。通过与其他相关实验的研究结果比较，本实验中的植物乳杆菌具有更高的抗氧化活性［6-8］。

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