HPLC-MS/MS快速测定婴幼儿食品中丙烯酰胺含量

杨旺火，黄永辉，陈言凯，刘飞，周鹏，柯振华，吴少明（福建省产品质量检验研究院，国家加工食品质量监督检验中心，福建福州350002）

HPLC-MS/MS快速测定婴幼儿食品中丙烯酰胺含量

杨旺火，黄永辉，陈言凯，刘飞，周鹏，柯振华，吴少明
（福建省产品质量检验研究院，国家加工食品质量监督检验中心，福建福州350002）

摘要：建立高效液相色谱-串联质谱仪测定婴幼儿食品中丙烯酰胺含量的方法。以13C3-丙烯酰胺为同位素内标，4%三氯乙酸水溶液作为提取液，经NaCl盐析，乙腈萃取净化，通过高效液相色谱-串联质谱仪多反应监测模式进行测定，内标法定量。该方法的线性范围为12.24 ng/mL～612 ng/mL，相关系数r2>0.999 9，检出限为7 μg/kg，定量限22 μg/kg。3种婴幼儿食品及辅助食品中丙烯酰胺的加标回收率为96.5%～104.2%，相对标准偏差为0.9%～2.5%。本方法具有操作简便、准确率高、重现性好等优点，可应用于多种婴幼儿食品中丙烯酰胺含量的测定。

关键词：丙烯酰胺；超高效液相色谱-串联质谱法；婴幼儿食品；同位素内标

丙烯酰胺（acrylamide）是一种神经毒素，马铃薯和谷类等淀粉类食品通过美拉德反应在高温加工过程中生成，国际癌症研究机构已将其列为对人类很可能的ⅡA类致癌物质[1]。自2002年瑞典国家食物管理局（Swedish National Food Administration）和斯德哥尔摩大学（Srockholm University）的科学家报道油炸马铃薯和焙烤食品中含有丙烯酰胺以及丙烯酰胺的潜在危害以来，德国、比利时、中国、日本等国的科学家相继发现热反应加工食品会产生丙烯酰胺[2-5]。

目前，我国食品中丙烯酰胺的监测种类主要集中在油炸和焙烤食品中。然而，早在2007年，欧盟就已经开始要求各成员国每年监控包括婴幼儿饼干、罐装辅食和谷类辅助食品在内的2000种食品中的丙烯酰胺含量。我国对婴幼儿配方食品、谷类辅助食品和罐装辅助食品等食品中丙烯酰胺的含量尚未进行风险监控和暴露评估，而婴幼儿的免疫系统尚未发育完全，更容易遭受危害，婴幼儿食品中丙烯酰胺更需要进行严格的监控。

目前丙烯酰胺的检测方法主要有高效液相色谱法[6]、气相色谱法[7]、液相色谱-串联质谱法[8-9]、气相色谱-串联质谱法[10-11]等。国内食品中丙烯酰胺的检测标准主要有GB/T 5009.204-2005《食品中丙烯酰胺含量的测定方法气相色谱-质谱（GC-MS）法》及SN/T 2096-2008《食品中丙烯酰胺的检测方法同位素内标法》，两个标准前处理样品均需经过提取，过固相色谱柱，过夜衍生，再萃取，然后上机处理，所用分析仪器是气质联用仪，分析时间长，效率低，且操作过程复杂，容易造成被测物损失。因此，选择简便、快速的前处理方法，建立HPLC-MS方法对婴幼儿食品中丙烯酰胺进行风险监控和暴露评估，为企业在生产中降低该物质的产生，指导人们健康饮食有着重要的意义。

1　材料与方法

1.1仪器与试剂

1290 Infinity超高效液相色谱串联6490三重四极杆质谱仪：美国Agilent公司；高速冷冻离心机（Aanti J-E）：美国Beckman Coulter公司；超纯水纯化系统（Milli-Q）：美国Millipore公司；分析天平（BT 224 S）：德国Sartorius公司；超声波振荡器（DS-8510 DTH）：上海生析超声仪器有限公司；旋涡混均器（XH-B）：江苏康健医疗用品有限公司；0.22 μm尼龙滤膜：天津市津腾实验设备有限公司。

丙烯酰胺标准品（纯度99%）：德国Dr.Ehrenstorfer公司；丙烯酰胺标-13C3标准品（纯度99%）：美国CIL公司；乙腈（色谱纯）：山东禹王实业有限公司化工分公司；甲酸（优级纯）：德国Merck公司；所用试剂除特别标注外均为分析纯试剂；试验用水为超纯水纯化系统制备的超纯水。

1.2标准溶液的制备

准确称取0.030 9 g丙烯酰胺于25 mL容量瓶中，用50%甲醇水溶解配制成浓度为1.224 mg/mL标准储备溶液。吸取适量丙烯酰胺标准储备溶液，用水配成24.48 μg/mL标准中间溶液。

吸取1.00 mL丙烯酰胺-13C3标准品于25 mL容量瓶中，用甲醇溶解配制成浓度为39.6 μg/mL内标储备溶液。吸取适量内标储备溶液，用水配成浓度为1.584 μg/mL内标中间溶液。

1.3样品前处理

称取1 g（精确至0.000 1 g）样品，于40 mL的离心管中，加入丙烯酰胺-13C3内标，加入10 mL 4%三氯乙酸溶液，涡旋后超声30 min，在15 000 r/min、10℃下离心5 min，取上清液5 mL，加入NaCl固体颗粒使之饱和，加入5 mL乙腈振荡萃取10 min，15 000 r/min离心取出乙腈层，下层再加入5 mL乙腈重复萃取一次，合并两次乙腈层，氮吹浓缩至近干，纯水定容1 mL，过0.22 μm滤膜，供超高效液相色谱-串联质谱仪测定。

1.4液相色谱条件

色谱柱：WatersBEHC18柱，1.7μm，100mm×2.1mm；柱温：40℃；进样量：5.0 μL；流速：0.3 mL/min；流动相：1%的甲醇和99%的0.3%甲酸水溶液，等度洗脱3.5 min。

1.5质谱条件

电离模式：电喷雾电离正离子模式（ESI+）；毛细管电压：3 000 V；干燥气温度：160℃；干燥气流速：16 L/min；雾化气压力：206.85 kPa；鞘气温度：350℃；鞘气流速：12 L/min；扫描模式：多反应监测（MRM）；丙烯酰胺及其同位素内标的质谱参数见表1。

2　结果与讨论

2.1流动相的选择

试验发现，采用水和甲醇为流动相时可以获得较大的响应和较好的峰型。由于丙烯酰胺极性较大，在反相色谱柱上的保留较弱，所以，以1%甲醇的有机相比例作流动相。进一步研究发现，在水相中加入适量甲酸有助于提高质谱响应，优化了0.1%、0.2%、0.3%、0.4%、0.5%不同浓度的甲酸溶液的影响。发现当甲酸浓度在0.1%、0.2%时响应值变化不大，当浓度达到0.3%时响应增大明显，但随着浓度的增加，响应值反而下降，由于甲酸浓度高，流动相的pH降低，容易缩短柱子的寿命。因此本研究采用甲酸浓度为0.3%的水溶液作为水相。

2.2流速的选择

不同流速对化合物的出峰时间、峰形都有一定影响，但流速太高会增加系统压力，过高的压力会缩短柱子使用寿命，试验比较了0.2、0.3、0.4、0.5 mL/min 4个不同流速对分析结果的影响。一方面，随流速的提高，标样的保留时间相应缩短，峰形也变得尖锐，峰宽变窄，另一方面，流速提高，保留时间的缩短，容易造成在实际样品分析时目标物与基质中杂质的分离度变差，干扰目标物的测定，且当流速增大，系统压力也增高，因此本研究选择流速为0.3 mL/min较为适合。

2.3质谱条件的确定

采用电喷雾离子源（ESI）正离子扫描模式对丙烯酰胺进行检测，对标准溶液以MS2 Scan扫描模式进行母离子全扫描，得到响应最强的母离子m/z 72.1，然后以Product Ion扫描模式查找子离子，得到两个响应最高，最稳定的子离子m/z 55.1、m/z 44.2，最后通过MRM模式优化两组离子对的碰撞能量。以同样的方法对丙烯酰胺-13C3内标的母离子以及子离子进行扫描优化，得到其母离子质量数为75.1，特征碎片离子为m/ z 58.1、m/z 29.1。在确定扫描参数后，对其它质谱参数进行优化，优化结果为毛细管电压3 000 V、干燥气温度160℃、干燥气流速16 L/min、雾化气压力206.85 kPa、鞘气温度350℃、鞘气流速12 L/min，扫描模式为多反应监测（MRM），扫描参数见表1。

2.4样品前处理条件的优化

相关资料研究测定丙烯酰胺时用的最多的是水做为提取溶剂，另外有少部分用了乙腈、甲醇等作为提取溶剂。本试验比较纯水、1%甲酸水溶液、5%三氯乙酸水溶液、1%氨水、乙腈和甲醇对实际样品中的丙烯酰胺的提取效果，发现用纯水和5%三氯乙酸水溶液提取时，响应最大。此外三氯乙酸还能起到沉淀蛋白的作用，溶液澄清，有利于后续样品的净化浓缩。比较了1%、2%、3%、4%、5%5个不同三氯乙酸浓度作为提取溶剂对提取效果的影响，试验发现当三氯乙酸浓度≥3%时，样品离心后上层溶液较为澄清，且当三氯乙酸浓度为4%时目标物的峰面积响应值也相应较大，考虑到高浓度酸对系统寿命及稳定性的影响，最后确定三氯乙酸提取液的浓度为4%。

丙烯酰胺的极性很强，采用水溶液作为提取溶剂时，水中溶解的极性物质较多，容易有共流出物对检测造成干扰，另一方面丙烯酰胺的分子量很小，质谱所监测离子质量数在80以下，而在这个质量范围内质谱测定时系统和流动相的分子碎片干扰比较严重，试验过程中发现样液中的丙烯酰胺所产生的质量数为55.1的子离子有严重的离子干扰，造成离子比例严重偏离丙烯酰胺标准品的离子比例，影响定量和定性结果，因此需要减小样品提取液的基质效应，对其进行净化处理。试验采取了空白加标的方法，比较了PEP串联MCX、PEP、MCX和乙腈+NaCl液液萃取净化共4种方法的净化效果，结果发现4种方法净化后的目标物的离子比例均落在了偏差的允许范围内，而乙腈+NaCl液液萃取法和MCX柱法处理后样品目标物相应明显大于其它两种方法，乙腈+NaCl方法的基线较MCX平稳，同时MCX柱的价格较为昂贵，乙腈+ NaCl法价格低廉，因此选择用乙腈+NaCl液液萃取法来对样品提取液进行净化。进一步研究发现，当用乙腈对提取液萃取两次后，回收率基本达到90%以上，同时在处理过程加入同位素内标，进一步校正了基质效应的影响，满足试验要求，因此确定对提取液进行两次的液液萃取净化处理，合并的乙腈层经氮吹、浓缩定容后上机测试，进一步提高检测限。

2.5线性范围及检测限

准确移取丙烯酰胺及丙烯酰胺-13C3标准工作液，逐步稀释制得质量浓度为12.24、24.48、61.2、122.4、244.8、612 ng/mL系列标准溶液，其中内标浓度为15.84 ng/mL，按照本试验的操作条件下分析，以丙烯酰胺定量离子色谱峰与内标峰面积比为纵坐标，丙烯酰胺标准溶液与内标浓度比为横坐标，绘制标准曲线，相应的回归方程和相关系数为：Y=0.244 3 X+0.043 1，r2>0.999 9，结果表明在12.24 ng/mL～612 ng/mL的质量浓度范围内线性相关性良好。

依照国际纯粹与应用化学联合会（IUPAC）的定义，检出限以信噪比S/N>3计，定量限以S/N>10计，按称样1.0 g，试验过程稀释倍数为2计算，得到本方法丙烯酰胺检出限7 μg/kg，定量限为22 μg/kg，典型的加标样品定量离子流图谱见图1。

2.6准确度和精密度

称取未含丙烯酰胺的婴幼儿奶粉和米粉样品以及有丙烯酰胺本底的婴幼儿饼干1.0g，分别添加3个不同含量水平的标准溶液，各做6个平行样，重复测试3次，计算各自回收率和相对标准偏差。结果如表2所示。

平均回收率在96.5%～104.2%之间，相对标准偏差在0.9%～2.5%之间，说明该方法具有较强的可靠性。

2.7实际样品检测

采用该方法对各20个批次的奶粉、米粉和饼干3种基质样品进行检测，其中奶粉和米粉样品均未检出丙烯酰胺，饼干中丙烯酰胺含量在110 μg/kg～130 μg/kg之间。由于丙烯酰胺是通过美拉德反应经过高温工艺后生成丙烯酰胺，因此与产品的生产工艺关系非常密切，饼干的生产工艺通常要经过油炸或挤压等高温处理，较容易生成丙烯酰胺。

3　结论

本方法采用4%的三氯乙酸作为提取液，既可以有效提取出婴幼儿食品中的丙烯酰胺，对蛋白质含量高样品还能起到沉淀蛋白、澄清溶液的作用，在样品的净化处理步骤采用廉价的NaCl和乙腈液液萃取的方法，大大降低了检测成本，同时在处理过程中加入同位素内标，有效地校正了目标物的损失。本方法具有操作简单、分析时间短、准确度高、经济适用等优点，对我国开展婴幼儿食品中丙烯酰胺的风险监控和暴露评估工作具有很好的实际参考价值。

参考文献：

[1]王爱红,夏昭林.丙烯酰胺危害健康的研究进展[J].中国公共卫生,2003,19(12):1534-1535

[2]ONO H,CHUDA Y,OHNISHI-KAMEYAMA M,et al.Analysis of acrylamide by LC-MS/MS and GC-MS in processed Japanese foods [J].Food Additives and Contaminants:Part A,2003,20(3):215-220

[3]MESTDAGH F,DE WILDE T,DELPORTE K,et al.Impact of chemical pre-treatments on the acrylamide formation and sensorial quality of potato crisps[J].Food Chemistry,2008,106(3):914-922

[4]GEREND S J,HEUSER F,SATTELMACHER B.Influence of nitrogen and potassium supply on contents of acrylamide precursors in potato tubers and on acrylamide accumulation in french fries[J]. Journal of Plant Nutrition,2007,30(9):1499-1516

[5]Zhang Yu,Zhang Genyi,Zhang Ying.Occurrence and analytical methods of acrylamide in heat-treated foods.Review and recent developments[J].Journal of chromatography A,2005,1075(1/2):1-21

[6]刘红河,陈春晓,柳其芳,等.高效液相色谱法测定淀粉类食品中丙烯酰胺研究[J].中国卫生检验杂志,2004,14(6):691-693

[7]周宇,朱圣陶.气相色谱法测定油炸、烘烤食品中丙烯酰胺-丙烯酰胺污染水平调查[J].理化检验(化学分册),2007,43(11):928-930

[8] 赵榕,邵兵,赵婕,等.液相色谱-电喷雾质谱/质谱法测定高温烹制的淀粉类食品中的丙烯酰胺[J].色谱,2005,23(3):289-291

[9]Yusa V,Quintas G,Pardo O,et al.Determination of acrylamide in foods by pressurized fluid extraction and liquid chromatographytandem mass spectrometry used for a survey of Spanish cerealbased foods[J].Food Addit Contam,2006,23(3):237-244

[10]仲维科,陈冬东,雍炜,等.气相色谱-质谱法测定油炸淀粉类食品中的丙烯酰胺[J].色谱,2005,23(3):312-314

[11]Bernhard Rothweiler,Eberhardt Kuhn,Harry Prest.气相色谱/质谱法分析食品中的丙烯酰胺[J].中国环境监测,2004,20(5):71-74

DOI：10.3969/j.issn.1005-6521.2015.24.035

收稿日期：2014-07-07

基金项目：福建省质量技术监督局科技计划项目（FJQI2012057）

作者简介：杨旺火（1984—），男（汉），工程师，硕士，研究方向：食品质量与安全。

Rapid Determination of Acrylamide in Infant Foods by HPLC-MS/MS

YANG Wang-huo，HUANG Yong-hui，CHEN Yan-kai，LIU Fei，ZHOU Peng，KE Zhen-hua，WU Shao-ming
（National Quality Supervision and Testing Center for Processed Food，Fujian Inspection and Research Institute for Product Quality，Fuzhou 350002，Fujian，China）

Abstract：A method using isotope internal standard for determination acrylamide in infant foods had been established by ultra high-performance liquid chromatography coupled with quadrupole tandem mass spectrometry（HPLC-MS/MS）.The sample was extracted with 4%trichloroacetic acid solution，and then purified by liquid-liquid extraction with acetonitrile，analyzed by HPLC-MS/MS in a multi-reaction monitoring （MRM）mode，an isotope internal standard was added for quantification.The correlation coefficient（r2）of acrylamide was more than 0.999 9 in linear range of 12.24 ng/mL-612 ng/mL.The detection limit and quantification limit were was 7 μg/kg and 22 μg/kg.The average spiked recoveries were in the range of 96.5%-104.2%with the relative standard deviations（RSD）of 0.9%-2.5%.The results showed this method was simple，high sensitivity，high accuracy and repeatable for the determination of acrylamide in kinds of infant foods.

Key words：acrylamide；ultra performance liquid chromatography-tandem mass spectrometry；infant food；isotope internal standard