大肠癌干细胞标记物及其相关信号通路的研究进展

大肠癌干细胞标记物及其相关信号通路的研究进展

梅命珠，隋华，张怡，程悦蕾，柴妮，朱惠蓉

(上海中医药大学附属曙光医院，上海 201203)

摘要：存在于大肠癌组织中的大肠癌干细胞，虽只占极少部分，但其对大肠癌的发生、发展起关键作用。目前，关于大肠癌干细胞的研究主要集中于大肠癌干细胞的筛选和鉴定方面及大肠癌干细胞的产生机制等，关于大肠癌干细胞的标记物有CD44、CD133、CD24、CD26、富含亮氨酸G蛋白偶联受体5与乙醛脱氢酶1，大肠癌干细胞的相关信号通路包括Wnt、Hedgehog和Notch通路。这些信号通路在维持大肠癌干细胞生长及增殖中具有重要作用。

关键词：大肠肿瘤；肿瘤干细胞；细胞表面标记物；信号通路

doi：10.3969/j.issn.1002-266X.2015.45.040

中图分类号：R735.3文献标志码：A

基金项目：上海市中医药事业发展三年行动计划(重大研究)项目(ZYSNXD-CC-ZDYJ048)。

收稿日期：(2015-06-01)

收稿日期：(2015-08-10)

肿瘤干细胞是存在于肿瘤组织中少量具有无限增殖和不定向分化潜能细胞群体，是形成不同分化程度肿瘤细胞和肿瘤细胞可不断增殖及发生转移的根源。与正常干细胞相比，肿瘤干细胞的增殖分化无序甚至失控，不能像正常干细胞那样有序高效地分化成为成熟细胞，反而易出现各种错误，致使组织发生恶变。因此肿瘤干细胞的存在可能是肿瘤恶变的原因。起初，肿瘤干细胞最早被发现存在于血液系统的恶性肿瘤中。随后，研究人员从乳腺癌实体肿瘤中分离出了肿瘤干细胞，首次证实了实体肿瘤中肿瘤干细胞的存在。此后，研究者先后从肺、消化道、前列腺、乳腺、结直肠等肿瘤的实体肿瘤中成功分离筛选出肿瘤干细胞。肿瘤干细胞的分离主要采用流式细胞法和免疫磁珠分选法，根据细胞表达不同表面标记的特征进行细胞群筛选，比较各组细胞的恶性生物学行为差异，从而筛选出优势细胞的表面标记。目前大肠癌干细胞表面的特异性生物标记有CD44、CD133、CD24、CD26、富含亮氨酸G蛋白偶联受体5 ( Lgr5) 与乙醛脱氢酶1(ALDH1)等。而诸多研究表明在大肠癌干细胞中存在着许多复杂的分子信号通路，如Wnt/β-catenin、TGF-β、Hedgehog以及Notch等信号通路在维持大肠癌干细胞的生长及增殖中具有重要作用，并且目前对其研究较为透彻。现对大肠癌干细胞标记物及其相关信号通路的研究进展情况综述如下。

通信作者：朱惠蓉

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1大肠癌干细胞的相关标记物

1.1CD44CD44是一种位于细胞膜上的多功能I类跨膜糖蛋白。作为细胞黏附分子主要参与细胞之间、细胞与基质之间的相互作用。Schulenburg等[1]在大肠癌组织中分离的CD44阳性和CD44阴性细胞的对比中发现，CD44阳性细胞无论是体内致瘤性，还是体外克隆形成能力，均明显高于CD44阴性细胞。研究发现，CD44阳性细胞具有干细胞的特征，其表现出的增殖、侵袭能力明显强于CD44阴性细胞[2，3]。因此，CD44已被公认为是大肠癌干细胞的标记物之一。

1.2CD133CD133最初被认为是造血干细胞和内皮祖细胞的标记物。其是一种5-跨膜糖蛋白，含有865个氨基酸。CD133最早被证明为结肠癌干细胞的表面标记，是通过小鼠肾被膜移植模型。研究发现CD133阴性细胞不能形成肿瘤，而CD133阳性的结肠癌干细胞具有自我更新和多向分化能力，以及传代致瘤的特征，故从功能学的角度证明CD133作为结肠癌干细胞表面标记的合理性[4]。但随后Shmelkov等[5]发现，CD133阳性和CD133阴性的肿瘤细胞移植到NOD/SCID的小鼠体内，则两种细胞均能很快地生成肿瘤。而且，CD133阴性的肿瘤细胞更具有侵略性，形成肿瘤的速度更快，说明转移的大肠癌细胞不论是否表达CD133，均具有引发肿瘤生成的能力。因此，CD133是否能作为大肠癌干细胞特异性的表面标记还有待于进一步研究。

1.3ALDH1 ALDH1是一种能催化细胞内的乙醛氧化为乙酸的解毒酶。已有研究证实，正常大肠组织干细胞存在于隐窝底部，主要表达ALDH1、CD133和CD44。故ALDH1被认为可用于鉴定正常肠道干细胞。而其与大肠癌肿瘤干细胞关系的研究，是在肿瘤组织和正常大肠组织的对比下进行。Huang等[6]在大肠癌组织中发现ALDH1高表达，并成功利用ALDH1的表达差异在动物模型内筛选出了大肠癌干细胞。此外，Dylla等[7]利用有限稀释法所获得的具有肿瘤干细胞特性的大肠癌细胞系，证明了ALDH1与大肠癌干细胞的相关性，并指出ALDH1的氧化作用是细胞对环磷酰胺发生耐药的重要机制。临床研究发现，大肠癌组织中ALDH1的染色程度与肿瘤细胞的分化程度间存在明显的正相关性，且ALDH1阳性患者较ALDH1阴性患者生存期更短[8]。以上结果提示，ALDH1可作为一个标记大肠癌干细胞的表面标记物，并可作为判断大肠癌患者疾病发展及其预后的重要指标。

1.4 Lgr5Lgr5是G-蛋白偶联受体家族成员之一，是由具有18个富含亮氨酸的重复单位和7个跨膜区域组成的大分子蛋白，在人体内分布广泛[9，10]。临床研究发现[11]，结肠原发肿瘤组织中Lgr5 mRNA的表达较正常对照组上调了64%；在已建立的Lgr5转基因裸鼠模型中，发现裸鼠于30周后成功长出结肠腺瘤，致瘤率达100%，提示Lgr5异常表达可诱导正常干细胞的肿瘤性增殖。此外，Kemper等[12]将Lgr5作为大肠癌干细胞的分选标记，发现Lgr5与肿瘤细胞间相互作用有关，因此认为Lgr5与大肠癌干细胞的侵袭转移密切相关。

2大肠癌干细胞的相关信号通路

2.1Wnt/β-catenin信号通路 Wnt/β-catenin是与大肠癌发生、发展关系最为密切的信号通路，亦是目前干细胞研究中认识最为清晰的信号通路之一。主要分为“经典的Wnt/β-catenin/TCF”和“非经典的Wnt”。正常成熟细胞β-catenin水平低，Wnt信号通路处于关闭状态。而肿瘤干细胞中，β-catenin降解障碍，胞质内游离β-catenin增多并与TCF/LEF-1结合进入细胞核，激活下游靶基因c-myc、cyclinD1转录，从而促进肿瘤的发生发展[13]。Vermeulen等[14]发现在大肠癌干细胞中，干细胞中Wnt/β-catenin信号高度活化，其上游主要靶基因Lgr5高水平表达，而普通成熟的大肠癌细胞中β-catenin信号几乎不活化，且Lgr5基因表达水平较低，提示大肠癌干细胞的形成可能与Wnt/β-catenin信号的激活有关。Onishi等[15]研究发现，在干细胞微环境的刺激下，β-catenin的转录活性明显高于普通肿瘤细胞；抑制Wnt信号通路的活化，可抑制肿瘤细胞生长。越来越多的证据[16]证实β-catenin信号在肿瘤干细胞的形成中发挥重要作用。因此，多数研究认为，Wnt/β-catenin信号通路是抑制肿瘤恶性病变的潜在靶点。

2.2TGF-β信号通路TGF-β信号通路可通过特异性结合并激活具有丝氨酸 / 苏氨酸激酶活性的细胞表面受体启动各种应答。通路中包括TGF-β、生长分化因子(GDF)、常见的活化素和骨形态发生蛋白(BMP)等。这些转化生长因子能参与多项人体细胞的活动, 包括胚胎发生、免疫、骨骼形成与重建、肿瘤发生、血管形成、细胞增殖分化等多种人体生物学事件。 Akinyi等[17]通过观察裸鼠肠上皮细胞标本，发现阻断TGF-β信号通路，可使抑癌基因APC发生结构突变，最终导致裸鼠发生侵袭性结肠腺瘤。而沉默Smad基因之后，TGF-β信号通路激活，从而促进肿瘤细胞的增殖。Zubeldia等[18]将高表达TGF-β1的Mc38细胞注射到小鼠脾脏，发现TGF-β1不仅能促进原发肿瘤细胞的生长，还能促使癌细胞向肝脏转移，这可能与TGF-β1引起了Mc38细胞中Smad基因的活化，从而增强细胞侵袭与迁移能力有关。Calon等[19]发现，在大肠癌发生肝转移之后，大肠癌组织中包含的干细胞会向周围组织中释放TGF-β，使得周围组织中的淋巴细胞、白细胞等免疫细胞释放白细胞介素-11，从而导致肿瘤微环境发生改变，使得大肠癌细胞可在异质的器官中得以存活。Yu等[20]通过稳转，使HCT116细胞株过度表达miR-21,发现TGF-β受体 (TGF-βR2)表达下调，而细胞株中干细胞比例增加，干细胞球的形成能力亦随之增强。

2.3Hedgehog信号通路 Hedgehog信号通路是调控胚胎发育的一条经典信号转导途径，在细胞的增殖和分化方面亦扮演重要角色[21]。Hedgehog是一种跨膜蛋白受体复合物。研究发现，当Hedgehog与受体Ptc结合时，Hedgehog对下游Smoothened (Smo)激酶的抑制效应被解除，Smo被激活使得下游Gli因子的降解作用被抑制，Gli继而从复合体中释放出来以全长的形式进入细胞核中启动相关基因表达[22]。多数研究已证实，胶质母细胞瘤、乳腺癌、胰腺癌、多发性骨髓瘤及慢性髓样白血病等的肿瘤干细胞均受到Hedgehog通路的调节作用，抑制这些细胞中HH通路的活性可明显降低其致瘤能力。有研究发现，DDE(一种含氯的污染物)通过激活Hedgehog/Gli通路，能增加人结肠癌干细胞自我更新和分化、重建成结肠癌细胞群体的能力[23]。说明Hedgehog信号通路在维持肿瘤干细胞干性及调节肿瘤干细胞生物学方面起着重要作用。Yoshimoto等[24]研究发现，Hodgehog信号通路对大肠癌细胞功能起调控作用，这一作用表现在促进炎症信号衰减和拮抗细胞凋亡两方面，而这两方面对于维持了促进大肠癌细胞增殖的肿瘤微环境的稳态具有重要调控作用。

2.4Notch信号通路 Notch 通路是肿瘤发生发展中研究较多的信号传导通路，进化上高度保守，在维持细胞增殖、分化与凋亡间的动态平衡等方面发挥重要作用。一个完整的Notch信号通路包括Notch受体、Notch配体、细胞内效应分子CSL 蛋白、Notch靶基因、其他效应物和Notch的调节分子等。研究[25]发现，阻断Notch通路可致人体内造血干细胞的减少和体外造血干细胞分化的加速，这提示Notch通路可能使胞核内与胞质内的相关蛋白结合，抑制与分化相关基因的转录，从而维持干细胞的未分化状态。Fender等[26]发现，Notch-1可通过促进大肠癌细胞的上皮间质化，从而维持大肠癌干细胞的多向分化潜能。此外，激活Notch信号通路，大肠隐窝细胞的分化能力降低，而大肠干细胞的增殖能力却明显提高[27]。研究证明[28]敲除Notch基因会使结肠癌干细胞丧失成瘤能力，促进肿瘤细胞的凋亡。当将Notch信号通路的受体基因敲除后(特别是Notch2)，会引起其下游的Met原癌基因、干性转录因子Oct4与Nanog及CD44表达明显下调[29]。Notch信号通路对于肿瘤细胞的增殖、分化和凋亡等方面有重要调控作用。因此Notch信号通路上的基因，有可能成为将来大肠癌治疗的潜在靶点。

3大肠癌干细胞的其他标记物及信号通路

肿瘤干细胞理论已在相关肿瘤中得到证实，但对它的研究尚处于初步阶段。因此作为干细胞标记物的基因和活化的信号通路，正在被不断发现。例如，CD24通过上调Src(酪氨酸激酶家族)，可激活ERK和PMAPK信号通路，从而促进肿瘤细胞的增殖分化，提示CD24亦是分选结肠癌干细胞的表面标记物之一[30，31]。在信号通路调控大肠癌干细胞的研究中，人们也逐渐发现这些通路之间并不是相互独立的，上述Wnt、Hedgehog和Notch三条信号通路之间即存在着复杂的串联。有研究表明Gli的活化能刺激Wnt靶基因的转录，同样暗示Wnt此时相当于Hedgehog的下游通路。然而，在某些病理应答中，Wnt通路中的分子如GSK-3β和β-catenin，同样也调节着Hedgehog通路中的特异位点。因此，有学者认为，Wnt、TGF-β、Notch、Hedgehog信号转导通路组成了复杂的干细胞信号网络调控体系，并且推测该体系可能还远不止目前这些。而这些网络之间的平衡对于干祖细胞的保持有重要意义，破坏这种信号网络可能导致病理变化而发生肿瘤。

综上所述，对正常干细胞分选标记物及信号传导通路的进一步认识，使我们对大肠癌干细胞的发生发展有了更深入的了解。但目前仍有很多问题有待明确：第一、目前尚未发现具有代表性和有较高特异性的大肠癌干细胞标记物，而标记物形成的生物学机制亦丞待明确；第二，大肠癌干细胞来源及维持其自我更新能力的机制仍未明确；第三，大肠癌的发病常为多因素所致，而大肠癌干细胞在其中起何种作用，目前仍不明确；第四，如何特异性杀死大肠癌干细胞，而不损伤正常大肠组织，从而实现真正的靶向治疗，目前尚缺乏有效的实施方法。因此，进一步深入研究大肠癌干细胞的分子生物学基础及生物学特性的分子机制，对于提高大肠癌的预防、诊断、治疗水平有重要意义。

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