营养素对水生动物生长发育相关基因表达的影响及机理研究

■许友卿 郑一民 丁兆坤

(广西大学水产科学研究所，广西南宁 530004)

营养素是机体进行新陈代谢的基础，对机体影响很大[1-5]。传统的水产动物营养学主要从表观水平上研究营养素的作用。然而，机体的新陈代谢、生长发育、遗传变异、免疫和疾病发生等生理和病理变化，本质上是由于体内基因的表达和调控改变的结果[6-10]。如果掌握了营养素调控基因表达的确切途径及机理，就能人为调控水产动物的营养代谢，预防营养及代谢疾病，促进它们健康生长。但是该领域的研究还处于起始阶段，相关问题亟待研究。

本文综述了营养素对水生动物生长发育相关基因表达的影响和机理研究的进展，旨在对其进行深入研究，以便更有效地利用营养素调控水生动物，提高它们的代谢、生长发育和生产性能，促进养殖渔业的健康生态发展，提高经济效益和社会效益。

1 营养素对生长发育相关基因表达的影响

1.1 营养素对GHGHR、IGF-1基因表达的影响

GH/IGF-1轴是动物机体中重要的内分泌生理轴，包括生长激素（growth hormone，GH）、生长激素受体（growth hormone receptor，GHR）和类胰岛素生长因子（insulin-like growth factor-I，IGF-1）等，主要调控机体的生长发育。GH对鱼类等脊椎动物的代谢、生长、繁殖、免疫、渗透压调节及其他生理功能发挥重要作用[11-14]。GH是通过其受体GHR及IGF-1的作用来调控生长的，IGF-1是GH促进生长的最重要介导物[15]，因此是该领域研究的重要对象之一。

营养素影响鱼IGF-1、GHR基因表达，因物、量、时和组织而异。在基础饲料中分别添加酵母硒0.25、0.50 mg/kg干饲料，导致团头鲂(Megalobrama amblycephala)脑垂体的MaGH基因表达水平分别比对照组提高了75.76%和50.51%；而添加茶多酚50、100 mg/kg干饲料显著提高团头鲂脑GHR2基因表达水平(P＜0.05)；二种添加剂均显著影响团头鲂肝IGF-1基因的表达水平(P＜0.05)，表明酵母硒和茶多酚可通过上调GH、IGF-1和GHR2基因mRNA的表达而促进团头鲂的生长性能[16]。Gómez-requeni等[17]分别用鱼粉（FM）、植物蛋白替代鱼粉50%(PP50)、75%(PP75)和100%（PP100）投喂金头鲷（Sparus aurata），禁食过夜后发现，FM组鱼肝GHR、IGF-1基因表达量是PP100组的4倍。Zheng等[18]报道，给牙鲆(Paralichthys olivaceus)饲喂超滤鱼水解物37 g/kg干饲料，其肝中的IGF-1 mRNA表达量是鱼粉对照组的1.4倍(P＜0.05)。用轮虫(RR组)投喂大西洋鳕(Gadus morhua)仔稚鱼，其于出膜后16 d和29 d的GH mRNA水平最高；而用汤氏纺锤水蚤和轮虫混合物(CR组)投喂，其GH mRNA水平于出膜后29 d最高[19]。Picha等(2015)[20]发现，于投喂期，所有实验组的混血条纹鲈（Morone chrysops Morone saxatilisc）肌肉IGF-1 mRNA表达量与生长率呈正相关。随着日粮中精氨酸水平增加，大异育银鲫(Carassis auratus gibelio)肝GH mRNA水平没有变化(P＞0.05)，而小异育银鲫脑下垂体GH mRNA水平明显增加，其中饲喂精氨酸17.6、13.0 g/kg干饲料的鱼肝IGF-1 mRNA水平比饲喂精氨酸5.4 g/kg干饲料的显著升高。但是，小异育银鲫的GH和IGF-1 mRNA水平显著高于大异育银鲫(P＜0.05)[21]。

禁食2周的虹鳟（Oncorhynchus mykiss）脂肪组织和红肌GHR1 mRNA表达量比正常饲喂对照组下降近1倍；当禁食4周，其肝GHR1 mRNA表达量下降近2倍；重新投喂后，其肝和脂肪组织的GHR1表达量恢复至连续投喂的虹鳟水平。然而，营养状况对红肌中的GHR1 mRNA表达量没有明显影响[22]。Kawanago等(2015)[23]报道，鰤鱼(Seriola quinqueradiata)幼鱼禁食3 d后，再重新投喂含支链氨基酸混合物（BCAA）0.4%、1%和2%的饲料，发现2%BACC组鱼于重新饲喂3 h和9 h后肝IGF-1和IGF-2表达量显著高于对照组（前者P＜0.01，后者P＜0.05）；1%BCAA组鱼在重新饲喂9 h后，其肝IGF-1 mRNA表达量略高于对照组，但不显著（P＜0.08）；而IGF-2 mRNA表达量显著高于对照组（P＜0.01）。2%BCAA组鱼血浆中的BCAA浓度显著增高，表明鰤鱼进食后合成氨基酸，可能是由于提高血浆中BCAA水平而诱导肝IGF-1和IGF-2表达的缘故。

1.2 营养素对CAPN和CAST基因表达的影响

钙蛋白酶（calpain，CAPN）系统参与肌肉生长分化、神经发育和细胞信号转导等正常生理过程，CAPN表达还会引起肌细胞肌原纤维降解[24-28]。CAPN是广泛存于动物体的一种特异性依赖钙激活的中性半胱氨酸巯基内肽酶，主要有三类：钙蛋白酶I（CAPN 1)、钙蛋白酶II(CAPN 2)和骨骼肌特异性蛋白(CAPN 3)[29]。钙蛋白酶抑制蛋白(Calpastain，CAST)是CAPN的特异性内源抑制剂，CAST表达可抑制肌蛋白水解[24-28]。Rolland等(2015)[30]用5种含不同水平甲硫氨酸(Met)的日粮(Met1、Met2、Met3、Met4、Met5)饲喂虹鳟，发现Met5组鱼肝Capn1表达量是Met1组的2.4倍，Met2组Capn2表达量是Met组的1.5倍，但各组间没有线性关系；而长亚型（CAST-L）和短亚型（CAST-S）的钙蛋白酶抑制蛋白基因表达量随着日粮Met水平的增加而增加，其中Met5组表达量最高，分别是Met1组的3.8倍和2倍，表明增加日粮Met的水平能减少鱼体蛋白质的降解。Preziosa等[31]报道，饥饿35 d的斑点叉尾鮰骨骼肌Capn1、Capn2、Capn3的表达分别比饥饿17 d的减少了2.3、1.3和13倍（P＜0.05）；而重新饲喂并没有改变这些基因的表达量。Cleveland等[32]发现，不同水平日粮（0.25%、0.5%、0.75% 生物量/d和饱食）及性成熟均影响二倍体和三倍体虹鳟蛋白降解的相关指标、CAPN 基因（CAPN1和CAPN2）的表达；对相同投喂水平者来说，未成熟二倍体和多倍体鱼的CAST1和CASTs基因表达较低，性成熟者会增加蛋白降解；而较高水平的饲料摄入不能缓和蛋白降解，却能阻止肌肉蛋白的净损失。Salem等[33]发现，虹鳟饥饿3周后，其CAPN催化活性增加，却减少CAST和CAST长型异构体（CAST-L）mRNA的表达。禁食15 d和30 d的金头鲷sacapns1b基因表达量分别是对照组的2倍和2.8倍；然而，重新饲喂14 d后，金头鲷Sacapn1、Sacapn2、Sacapns1a、Sacapns1b的表达量分别比对照组降低了65%、50%、42%和70%。因此，可通过营养成分及水平调控金头鲷CAPN基因的表达[34]。

1.3 营养素对Pept1基因表达的影响

小肽是蛋白质消化的主要产物。小肽转运蛋白（peptide transporter，PepT）参与二肽和三肽的跨膜转运[35]，促进蛋白质的消化、吸收和代谢。小肽与游离氨基酸的吸收不同，两者比较，小肽具有吸收快、耗能低、不易饱和、各种肽之间转运无竞争性与抑制性等特点。小肽转运蛋白1（PepT1）是小肽转运蛋白中研究最广泛而重要的一种[36]。PepT1基因存在于许多脊椎动物，包括哺乳动物和鸟类[37-41]、斑马鱼(Danio rerio)[42]、鲤鱼（Cyprinus carpio）[43]、草鱼[44]、大西洋鲑（Salmo salar）[45]、底鳉(Fundulus heteroclitus)[46]、海鲈（Lateolabrax japonicus）[47]和虹鳟[48]等。

日粮中蛋白质的水平可影响鱼PepT1基因的表达。Liu等[49]将含有5种不同蛋白质水平（22%、27%、32%、37%和42%）的日粮投喂三倍体鲫-鲤鱼1个月，发现投喂42%蛋白质日粮组的鱼小肠PepT1基因表达量最高，是27%蛋白日粮组鱼的7倍。如果长时间日粮营养不良，尽管投喂低蛋白日粮，鱼小肠的PepT1基因表达也升高，这是代偿作用，以加速蛋白质代谢和补偿生长。经过7 d饥饿后，欧洲鲈鱼PEPT1基因mRNA的含量降低，再投喂则其PEPT1基因 mRNA的表达水平显著提高[50]。Cai等（2015）[51]用鱼粉作为对照组的主要蛋白源，分别用超滤鱼肉水解渗透物（PUFH)、超滤后鱼肉水解渗余物(RUFH)和无超滤鱼肉水解物(NUFH)替代40%鱼粉投喂大黄鱼幼鱼，发现饲喂PUFH-40的鱼PepT1表达水平是RUFH-40鱼的2.6倍（P＜0.05），也显著高于NUFH-40日粮组和对照组。表明添加PUFH更能影响大黄鱼幼鱼对蛋白质的消化和吸收。

日粮影响鱼PepT1基因的表达，因蛋白质元素而异。Ostaszewska等[52]分别用添加Lys-Gly二肽、游离Lys、Gly及不添加Lys的饲料投喂鲤鱼，发现投喂添加Lys-Gly二肽日粮的鲤鱼PepT1基因表达量最高，未添加Lys日粮组鲤鱼表达最低，表明在鱼日粮中添加一定量小肽会增加其PepT1基因的表达，该实验中Lys-Gly二肽效果最好。给虹鳟投喂富含不同蛋白源形式的三种饲料(赖氨酸-甘氨酸二肽、晶体赖氨酸和晶体甘氨酸、商品饲料)4周，发现以赖氨酸-甘氨酸二肽形式作为主要蛋白源的饲料显著促进了PEPT1基因mRNA的表达[48]。如果给鳕鱼幼鱼分别投喂富含小肽和晶体氨基酸的饲料，虽然对在鱼体小肠同一区域的PEPT1基因水平产生了显著影响，但是与鱼粉对照组比较却无显著性差异[53]。Amberg等[54]给大西洋鳕鱼(Gadus morhua)仔稚鱼分别投喂野生浮游动物和营养强化的轮虫，大西洋鳕PEPT1基因水平均无显著差异。

1.4 营养素对脂肪酸去饱和酶基因表达的影响

高度不饱和脂肪酸(HUFAs)，特别是二十二碳六烯酸(DHA)和二十碳五烯酸(EPA)是鱼类必需营养素，在维持机体的正常机能、促进生长、发育、繁殖和提高成活率等方面发挥重要的生理作用[55]。近来，水产动物合成HUFAs的几个关键去饱和酶—Δ6、Δ5和延长酶基因广为研究，其中通过营养素调节Δ5和延长酶基因的表达是研究热点之一[56-60]。Li等[61]用含不同比例葡萄籽油（GO）和亚麻籽油（LO）的日粮投喂皱纹盘鲍（Haliotis discus hanai）120 d后，发现投喂含50%GO日粮者的两种Δ5脂肪酸去饱和酶基因（Hdfad1和Hdfad2）在肌肉表达量分别是对照组的2.34和2.5倍(P＜0.05)；投喂100%LO日粮组的Hdfad1和Hdfad2表达量分别是0%GO/LO日粮组的2.09和2.46倍（P＜0.05）。随着日粮中亚油酸（LA）和α-亚麻酸（ALA）含量增加，Δ5 Fads表达量增高，皱纹盘鲍肌肉中的长链多不饱和脂肪酸（PUFAs)合成量也随之增加。但大量摄取LA和ALA则会抑制DHA合成，影响皱纹盘鲍的生长性能。Yang等[62]用不含油脂类饲料（对照组）、含鱼油（FO）饲料、含大豆油(SO)饲料和鱼油/大豆油（FO/SO）=1∶1混合饲料分别投喂中华绒螯蟹（Eriocheir sinensis）幼蟹，于168 d和238 d取样测定，发现投喂SO饲料238 d的蟹肝胰脏的类Δ6脂肪酸去饱和酶基因的表达量分别是对照组、FO组和FO/SO组之蟹的2.1、6.9和1.52倍；而且投喂SO饲料238 d的蟹肝胰脏类Δ6脂肪酸去饱和酶基因表达量高于投喂SO 168 d之蟹。当用添加不同比例FO（0.5%、1%、1.5%、2%、2.5%）和对照组饲料（不添加FO）投喂玉虎杂交鲍(Abalone)90 d，发现投喂含1.5%FO日粮组鲍肌肉延长酶2基因表达最高，是1%FO组的5倍，还显著提高鲍的n-3 PUFAs水平。而投喂含0.5%FO日粮组鲍肌肉中的Δ6脂肪酸去饱和酶基因表达最高，是2.5%FO组的5倍[63]。Kuah等（2015）[64]和Xue等（2015）[65]分别报道，日粮中添加高水平的C18PUFA能提高鱼体中Δ5、Δ6脂肪酸去饱和酶基因的表达量，表明日粮中不饱和脂肪酸能诱导Δ5、Δ6脂肪酸去饱和酶基因mRNA的转录。然而，Thomassen等[66]报道，给大西洋鲑分别投喂鱼油（FO）或菜籽油（RO）+EPA+DHA的饲料，会抑制Δ5和Δ6脂肪酸去饱和酶基因表达，还抑制延长酶2基因的表达。

2 营养素影响水生动物生长发育相关基因表达的机理

营养素可通过直接或间接途径调控每个基因调控点调控基因的表达[67]。这种调控作用既可在基因转录水平，也可在转录后[68]。对真核细胞而言，其mRNA的5’和3’端非编码区 (UTR)含有控制mRNA的腺苷聚合、稳定、在细胞中分布定位以及翻译的调节信号，对基因表达的调节发挥核心作用。因此，某些养分可通过mRNA UTR，特别是3’UTR实现对基因表达的调控作用[69-70]。

雷帕霉素靶向基因（mTOR）信号通路被认为是一个调节细胞周期和细胞生长的信号汇聚点，在基因转录、蛋白质翻译和核糖体合成等生物过程中发挥重要作用，对细胞增殖、生长、分化、自噬、血管形成发挥中心调控点的作用[71]。在哺乳动物，氨基酸通过激活mTOR/p70 S6激酶转导途径与胰岛素共同调节蛋白合成[72-73]。

蛋白激酶B（Akt）经由磷酸化作用和FoxO1转录因子（FoxO1）调节代谢中间阶段相关的基因表达，也通过TOR激活作用调节蛋白质合成[74]。TOR激活作用还有助于脂肪酸合成，主要通过阻断固醇反应元件结合蛋白(SREBP1)成熟形式的核聚积和随后的SREBP1靶基因的表达[75]。Lansard（2010）等[76]研究发现，在虹鳟肝细胞中，胰岛素和氨基酸调节脂肪合成，并通过TOR-依赖途径调节SREBP1基因表达。目前，鱼类TOR信号通路的研究较少。Gutiérrez等[77]通过体外投喂饲料和体内添加胰岛素实验研究，发现营养物质对虹鳟鱼TOR信号通路的调节是通过对TOR及其下游 PKB、p70S6k等基因磷酸化实现的。然而，关于营养物质是否通过影响TOR基因mRNA表达来调控TOR信号通路，从而调控鱼体的生长还在争议中。Wu等[78]报道，饲料中添加胆碱会促进建鲤后肠TOR基因的表达，影响肌肉和肝TOR mRNA表达。然而，Li等[5]报道，投喂含不同氨基酸的饲料对大黄鱼仔稚鱼TOR基因mRNA的表达未产生显著影响。Luo等[79]也报道，营养物对军曹鱼TOR基因的表达量无显著影响。Lansard等[80]用高植物蛋白替代鱼粉实验，也发现对虹鳟肝的TOR信号通路无显著影响。因此，关于TOR信号通路在鱼体的调控机制尚待研究。

3 小结

综上所述，营养素调节功能基因的表达是十分复杂的生物学过程，其具体机制尚缺少了解。然而，该领域是分子营养学的核心内容，深入研究和理解之是营养学者的使命。随着营养学特别是分子营养学的发展，深入研究和理解营养素对水生动物生长发育相关基因表达的影响及机理刻不容缓，只有综合利用生理、生化、遗传和现代分子生物学等技术，研究营养素特别是必需营养素对水产动物生长发育生物学的影响及机制，真正理解之，才能更积极主动和正确地用营养素调控水产动物，有效促进水产动物代谢、生长发育和生产性能，发展规模的健康生态和可持续养殖渔业，努力提高经济效益和社会效益。