植物多糖对断奶仔猪肠道树突状细胞信号通路的调控

■李孟伟 陈清华

（湖南农业大学动物科学技术学院，湖南长沙 410128）

现代养猪业中仔猪生产是养猪生产的重要基础和关键环节。研究和生产实践证明，病原微生物、环境卫生和断奶应激等因素均可引起仔猪的机体免疫力下降、肠道结构异常与功能紊乱，导致消化不良、腹泻、生长受阻，甚至死亡。传统的抗生素等饲喂饲养技术虽然能在一定程度上维持仔猪健康、提高生长速度，但由于抗生素的大量使用，其负面效应也日益突出，长期使用抗生素导致细菌产生抗药性、动物机体免疫力下降及动物产品中的药物残留，对人类健康具有潜在的危害性。在当前生产实践中，迫切需要采取有效措施来改善仔猪的肠道发育状况，维护和发挥肠道功能，提高仔猪的生长性能和健康水平。

植物多糖是从中草药中提取、分离、纯化的生物活性多糖，因具有重要的免疫学功能，在动物生产中作为畜禽免疫增强剂和代谢调控剂而受到广泛关注(Brown G D，2001)。研究表明，多糖与树突状细胞（dendritic cell，DC）等免疫细胞表面模式识别受体(pattern recognition receptor，PRR)结合，刺激DC成熟，提高DC表面分子的表达，促进细胞因子的分泌，提高DC的抗原提呈能力，增强DC促淋巴细胞增殖的能力，调控DC免疫应答，从而增强机体的免疫功能。本文综述了多糖激活DC的免疫调节作用及其信号通路，从细胞水平和分子水平阐明多糖免疫调节作用机制，为多糖的深入研究和应用开发提供参考。

1 树突状细胞

随着研究的深入，人们对多糖的免疫调节作用机制的认识已达到分子受体的水平，多糖生物活性功能的发挥有赖于与细胞上相应受体的相互作用。研究表明，多糖与树突状细胞（dendritic cell，DC）等免疫细胞表面模式识别受体(pattern recognition receptor，PRR)结合启动免疫应答，从而发挥其免疫调节作用。能识别多糖类的PRR有：Toll样受体(TLR)、β-葡聚糖受体、CD14、清道夫受体(SR)、补体受体3(CR3)以及Dectin-1 等(Laechini等，2006；Gangloff等，2005；Yan 等，2000；Eberle等，2012)。研究表明，多糖通过和受体相互作用向巨噬细胞和树突状细胞传递信号，从而激活巨噬细胞和树突状细胞，其信号途径主要涉及：丝裂原-活化蛋白激酶(MAPK)、蛋白激酶C(PKC)、Toll样受体(TLRs)、异常环氧酶-2(COX-2)、活化因子蛋白-1(AP-1)、核因子κB(NF-κB)等。配体与PRR的结合可触发NF-κB等介导的信号发生，引发胞内一系列信号级联反应，导致转录激活和炎症相关因子的产生，诱导相关免疫基因表达，激活免疫反应。

肠道是机体最大的免疫器官，肠黏膜被认为是执行局部特异性免疫反应的重要场所，分布于其中的系列抗原提呈细胞（Antigen Presenting Cells，APC）在肠道免疫反应中发挥着极重要的作用。APC提取抗原，经加工后呈递给T细胞，从而介导特异性免疫防御(Swiactzak等，2012)。DC是目前已知抗原提呈能力最强的专职APC，是适应性免疫的主要启动者，负责对抗原的识别、加工处理与分类，将抗原信息提呈给T细胞，启动抗原特异性T细胞应答。DC是CD4+T细胞介导的原发和继发性免疫反应最强的激发者。DC摄取抗原后，通过接触抗原而诱导DC的成熟(Pletinckx等，2011)。DC的成熟是增强免疫力的关键(Ballestrero等，2008)，随着DC的成熟，高水平地表达主要组织相容性复合物抗原II（MHC-II），CD80、CD86等共刺激分子，DC细胞膜MHC-II-肽复合物逐渐增多，并将大量抗原物质呈递给T细胞受体，诱导T细胞活化，启动MHC-II类的CD4+T细胞反应(Drakes等，2004；Steinman等，2006；Hailong等，2011)。DC与T细胞结合后，通过自分泌或诱导其他细胞分泌大量IL-2、IL-12等细胞因子，启动与CD4+T细胞相关的免疫应答。成熟DC还分泌趋化因子，趋化初始型T细胞聚集于抗原部位，增强对T细胞的活化能力。DC表面的PRR，如Toll样受体(TLR)，识别病毒、细菌、寄生虫等病原体的微生物相关分子模式，介导微生物与细胞之间的相互作用，是连接天然免疫与获得性免疫的桥梁，在调控DC成熟过程中起到了重要作用。DC可通过TLR来识别抗原分子，如肽聚糖、脂多糖、脂磷壁酸等(Kaisho等，2001)，配体与TLR结合导致TLR的聚合而活化，激活信号通路分子，引起NF-κB、IRF-3等转录因子的活化从而释放出大量效应分子发挥免疫调节作用(Fritz等，2007)，从而引起T细胞免疫应答(Han等，2009)。

目前也有部分关于其它多糖与DC表面TLR激活NF-κB等信号转导途径而发挥免疫调节作用的报道。Li等(2012)发现，甘草多糖可促进小鼠髓源DC表达CD80、CD86和MHC I-A/I-E等细胞表面分子，分泌IL-12 p70细胞因子。Meng等(2011)证实，灵芝多糖可促进小鼠髓源DC表面分子CD86、CD40和MHCII的表达与细胞因子IL-12的分泌。此外，研究还表明云芝多糖(Kanazawa等，2004)、黄芪多糖(Shao等，2006)、枸杞多糖(Zhu 等，2007)、虫草多糖(Song等，2012)、桑黄多糖(Kim等，2004)等均能促进DC表达表面分子CD11c、CD80、CD86、MHC-I、MHC-Ⅱ，提高细胞因子IL-12分泌，进而增强DC与T细胞之间免疫信号的转导，诱导DC的成熟进而发挥免疫增强作用。冯婷等(2010)研究结果表明，牛膝多糖(ABPS)能够促进小鼠骨髓来源性DC的分化、成熟及表面标记CD86、CD1la的表达，提高DC的抗原递呈能力。ABPS调节DC分化与成熟的相关因子和信号途径研究成为阐释其分子免疫机制的首要任务。

2 TLR4介导信号通路产生免疫应答

Toll样受体（TLRs）是参与天然免疫的细胞跨膜受体及病原模式识别受体，是广泛存在于昆虫、脊椎动物和植物中的进化上高度保守而古老的蛋白质家族，通过启动天然免疫反应和激发适应性免疫反应的信号传导，在宿主防御微生物病原体感染过程中发挥重要的作用。TLRs可根据细胞内定位的不同被分为两个亚家族，即位于细胞膜表面的TLR1、TLR2、TLR4、TLR5、TLR6和TLR11及位于胞内膜成分的TLR3、TLR7、TLR8和TLR9(Kawai等，2008)。TLR4是最早鉴定的Toll样受体，是介导先天免疫和炎症反应的关键细胞膜受体，是革兰氏阴性菌细胞壁内毒素主要成分脂多糖（LPS）向细胞内传递信号的主要受体(Kawai等，2010)，能识别特定微生物的保守分子成分，激活信号转导途径，诱导炎症反应，与动物对疾病的抗应激性或易感性相关(Joan等，2012)。骨髓样分化因子88（MyD88）是TLR4信号转导通路中关键蛋白，是信号向下游转导的关键靶分子。MyD88依赖性信号转导途径是TLRs信号传导的共同通路(Roach等，2013)。机体受到刺激时TLR4激活MyD88，活化的MyD88可聚集并结合IL-1受体相关激酶（IRAKS），引起IRAKS-1磷酸化，使其从受体复合体上解离，作用于肿瘤坏死因子相关因子6（TRAF6），激活NF-κB和MAPK两条通路启动下游元件(Joh等，2012)，从而产生一系列的免疫应答。

2.1 TLR4/NF-κB信号传导途径

NF-κB是真核细胞中普遍存在的一种转录因子，在调节免疫应答、炎症反应、细胞增殖、分化及凋亡等方面起关键作用。NF-κB的活化是DC成熟的标志之一，也是DC刺激T细胞活化的必要条件。NF-κB位于TLRs下游信号通路的枢纽位置，参与免疫反应及细胞增殖与分化等过程，当细胞受到应激刺激后，IκB激酶发生磷酸化，使p50/p65异二聚体表现出NF-κB活性而进入细胞核，启动基因转录(Wu等，2009)。大多炎症介质由NF-κB和激活蛋白-1（AP-1）介导(Chun等，2012)。AP-1由c-jun蛋白和c-fos蛋白家族成员组成，在应激因素刺激下使c-fos和c-jun激活，调控多种细胞因子、单核细胞趋化蛋白-1（MCP-1）、细胞间黏附分子（ICAM-1）、趋化因子CCL2等基因的表达，启动基因转录的分子开关，从而参与应激、炎症、肿瘤等多种病理过程(Lee等，2011)。TLR4受正负调控导致AP-1及NF-κB等转录因子活化，且NF-κB的产生可以负反馈调节TLR4的激活，介导白细胞介素、肿瘤坏死因子-α（TNF-α）、γ-干扰素(INF-γ)等炎性介质基因表达，触发体内炎症连锁反应，引起全身炎症反应综合征和多器官功能障碍综合征等疾病(Ben等，2012)。TLR4/NF-κB是机体炎症和免疫反应调节的重要环节，抑制该信号传导途径对机体发挥免疫防御功能至关重要。研究表明，在DC的分化、成熟信号传导通路中，NF-κB起着决定性作用，多种胞外刺激信号都能引起NF-κB的核转位及其下游不同基因的活化，从而改变DC的分化方向及其免疫活性(Rescigno等，1998)。Guo等(2008)研究表明，ABPS能缓解免疫应激仔猪的生长性能和神经内分泌的改变，推测其机制可能与其抑制了NF-κB的激活进而抑制炎性介质的分泌有关，但ABPS作用机理和通过启动哪些下游元件发挥作用需进一步证实和探索。

2.2 TLR4/MAPKs信号传导途径

MAPKs是存在于真核细胞的一组高度保守的丝氨酸/苏氨酸蛋白激酶，包括细胞外信号控制激酶(ERK)、c-Jun氨基末端激酶(JNK)和p38。当受到多糖、促炎细胞因子等各种胞外刺激后，通过引发DC胞内两个丝氨酸残基磷酸化来激活MAPK，激活的MAPK转位到细胞核，通过磷酸化蛋白质控制染色体结构，以及通过磷酸化转录因子（如活化因子蛋白-1，AP-1）来进行基因的转录(Schorey等，2003)。目前已发现在哺乳动物体内有五条并行的MAPKs信号通路，其中p38MAPK和JNK属于“应激诱导”的MAPK，在炎症与细胞凋亡等应激反应中发挥重要作用，也是TLR4的关键下游信号通路。P38MAPK信号转导通路是信号由细胞表面转导到细胞内部的重要传递者，主要参与细胞的基因转录、应激反应、炎症反应和免疫调控，被认为是细胞信息传递的共同通路(Gao等，2010)。MKK3和MKK6是p38MAPK信号通路的两个上游激活因子，当p38 MAPK信号通路活化受到抑制之后，抑制细胞增殖，减轻炎症反应，降低损伤。JNK的上游激酶MKK4和MKK7通过双磷酸化JNK的苏氨酸和酪氨酸位点激活JNK，抑制JNK信号通路活化进而阻断细胞因子及炎症介质的合成、释放或作用是治疗炎症性疾病的关键(Owen等，2013)。目前寻找p38MAPK和JNK信号通路活化的抑制剂成为开发新药物的一个靶点。陈清华(2008)研究发现，ABPS可通过降低炎症和氧化应激保护仔猪免受LPS激发的免疫反应损伤，ABPS对免疫反应的调控作用很有可能与该信号通路有密切关联。

3 前景与展望

植物多糖因其具有免疫调节活性而成为动物生产上极具前景的替代抗生素的绿色饲料添加剂，具有无毒、不产生抗药性的特点(陈清华等，2007；邹云等，2014)。若能深入了解植物多糖对仔猪肠道健康、增强免疫力的作用机理、信号传导途径，则为解决仔猪肠道健康难题提供有效途径。同时，能从分子水平深入揭示植物多糖调控免疫功能的机制，为植物多糖在动物生产、食品营养、医学保健领域的推广应用提供科学依据。可为植物多糖生物学功能研究、仔猪肠道健康研究、植物多糖饲料添加剂的研制与应用提供理论依据和探索新的途径，对畜牧业可持续性发展具有重要的理论和实践意义。