水产饲料中复方硝基酚钠的高效液相色谱法分析

■邢丽红 冷凯良 孙伟红 李兆新 付树林 孙晓杰

（农业部水产品质量安全检测与评价重点实验室农业部水产品质量安全风险评估实验室（青岛）中国水产科学研究院黄海水产研究所，山东青岛 266071）

复方硝基酚钠是20世纪60年代由日本旭化学工业株式会社最先发现的一种高效植物生长调节剂，由对硝基酚钠、邻硝基酚钠和5-硝基邻甲氧基苯酚钠及其助剂按一定比例混配而成[1-2]。复方硝基酚钠是一种新型强力细胞赋活剂，在农业、畜牧和渔业上有广泛应用。由于复方硝基酚钠的价廉高效，使得化肥生产商在肥料生产过程中，添加少量的复方硝基酚钠，以增强其肥效，降低成本[3]。我国农业部公告第193号《食品动物禁用的兽药及其它化合物清单》中将硝基酚钠列为禁用药物。

现有文献报道，硝基酚类化合物的测定方法主要有：电位法[4]、分光光度法[5]、高效液相色谱法[6-7]、气相色谱法[8-9]、液-质联用法[10-11]和气-质联用法[12-14]等。电位法和分光光度法干扰较多，灵敏度较差；气相色谱法分析具有较高的灵敏度，但前处理过程需要进行衍生化操作，对操作人员有较高的要求，步骤较为繁琐；液相色谱-质谱法和气相色谱-质谱法的检测成本较高。而采用液相色谱法分析则不需衍生，前处理操作相对简单，应用最为广泛。

我国是世界水产养殖大国，对水产饲料的需求巨大。复方硝基酚钠在虾蟹等水产动物饲料中的添加量约为0.02‰～0.03‰。目前，水产饲料中复方硝基酚钠含量的检测方法还未建立。因此，本研究采用高效液相色谱法建立复方硝基酚钠在水产饲料中含量的检测方法，从而为水产饲料样品中复方硝基酚钠的质量控制提供技术支持。

1 材料与方法

1.1 实验仪器

Agilent 1100高效液相色谱仪，配紫外检测器（美国Agilent公司）；Waters 2695高效液相色谱仪，配紫外可变波长检测器（美国Waters公司）；高速离心机（美国Thermo Fisher公司）；涡旋混合仪（美国Talboys公司）；旋转蒸发仪（德国Heidoplh公司）；超声波清洗仪(昆山市超声仪器有限公司)；Gradient A10 Mill-Q超纯水仪(美国Millipore公司)。

1.2 药品和试剂

对硝基酚钠标准品、5-硝基邻甲氧基苯酚钠标准品：纯度＞99.0%(Sigma公司）；邻硝基酚钠标准品：纯度＞99.0%(东京化成工业株式会社）；甲醇、乙腈、正己烷：色谱纯（德国Merck公司）；无水硫酸钠、氢氧化钠、磷酸：分析纯（国药集团化学试剂有限公司）。

1.3 溶液配制

对硝基酚钠、邻硝基酚钠、5-硝基邻甲氧基苯酚钠标准储备液：分别准确称取对硝基酚钠、邻硝基酚钠和5-硝基邻甲氧基苯酚钠对照品各约0.010 0 g，用甲醇溶解并定容至10 ml，配成浓度为1 mg/ml的单标标准储备液；对硝基酚钠、邻硝基酚钠和5-硝基邻甲氧基苯酚钠混合标准使用液：准确移取适量对硝基酚钠、邻硝基酚钠和5-硝基邻甲氧基苯酚钠单标标准储备液，用甲醇逐级稀释配成浓度为100 μg/ml和10 μg/ml混合标准使用液。

1.4 样品前处理

1.4.1 提取和净化

称取试样5 g(精确到0.01 g)，置于50 ml离心管中，加入2 g无水硫酸钠，加入15 ml乙腈，涡旋混合1 min，使样品分散均匀，超声提取10 min，于8 000 r/min离心10 min，将上清液全部转移至100 ml离心管中，残渣再用乙腈重复提取两次，每次乙腈用量均为10 ml。提取液合并入100 ml离心管中。在提取液中加入10 ml正己烷，涡旋混合1 min，弃去正己烷。再加入10 ml正己烷重复上述操作。将提取液转移入100 ml梨形瓶中，加入4 mol/l氢氧化钠溶液100 μl，35℃下减压浓缩至近干。再加入1.95 ml甲醇-磷酸水溶液，充分涡旋溶解残余物，再加入50 μl磷酸，涡旋混合均匀，并于10 000 r/min离心10 min，清液过0.45 μm微孔滤膜，供高效液相色谱仪测定。

1.4.2 标准曲线的配制

准确移取适量对硝基酚钠、邻硝基酚钠和5-硝基邻甲氧基苯酚钠混合标准使用液，用流动相稀释成浓度分别为0.5、1.0、2.0、5.0、10.0 μg/ml和20.0 μg/ml混合标准工作液，供高效液相色谱仪测定。

1.5 色谱参考条件

色谱柱：AgelaVenusil XBP C18(2)，250 mm×4.6 mm，5 μm；流动相：0.1%磷酸溶液∶甲醇=63∶37（V/V）；柱温：40 ℃；流速：1 ml/min；进样量：20 μl；紫外检测器：波长280 nm。

2 结果

2.1 方法的检出限和定量限

方法的检测限（LOD）一般是根据信噪比外推得到，然而由于基质干扰等因素的影响，在进行实际样品测定时，LOD通常很难实现。方法的检测限和定量限是按样品实际添加计算得到的，在空白饲料中添加硝基酚钠混合标准溶液，按照1.4的方法处理样品，1.5的方法确定的色谱条件进样，记录色谱图。以检出的对硝基酚钠、邻硝基酚钠和5-硝基邻甲氧基苯酚钠的峰高为3倍基线噪音值时所对应的浓度计算，得到检出限为0.5 mg/kg。以检出目标峰的峰高为10倍基线噪音值时所对应的浓度计算，得到定量限为1.0 mg/kg。饲料中硝基酚钠添加样品色谱图及空白样品色谱图见图1～图2。

2.2 方法的线性范围

取系列硝基酚钠混合标准溶液进行分析，以峰面积对浓度绘制标准工作曲线，得到三种化合物的线性回归方程，各物质在0.5～20 μg/ml浓度范围内，线性关系良好，相关系数r2＞0.999。当样品中待测目标物被检出，且浓度超出线性范围时，需稀释处理后再次测定。线性回归曲线及方程见图3～图5。

图1 饲料中添加硝基酚钠色谱图（添加水平：1.0 mg/kg）

图2 空白饲料样品色谱图

图3 对硝基酚钠校正曲线

图4 邻硝基酚钠校正曲线

图5 5-硝基邻甲氧基苯酚钠校正曲线

2.3 回收率和精密度

方法的准确度用回收率表示。分别以鱼饲料、虾饲料、蟹饲料样品为测试对象，添加不同水平的对硝基酚钠、邻硝基酚钠和5-硝基邻甲氧基苯酚钠，添加浓度为1～20 mg/kg时，得到的实验结果如表1～表3所示。本方法测定对硝基酚钠、邻硝基酚钠和5-硝基邻甲氧基苯酚钠批内变异系数见表1～表3，计算批间变异系数是在不同天分别测定3次，本标准的批内、批间变异系数均在15%以内。

3 讨论

3.1 色谱条件的优化

由于对硝基酚钠、邻硝基酚钠和5-硝基邻甲氧基苯酚钠是盐溶液，在普通C18反相色谱柱上难以保留，无法达到分离效果，但在酸性条件下将其转变成硝基苯酚的形式就可以在C18反相色谱柱上保留。因此本实验选择了磷酸水溶液和甲醇作为流动相，并通过反复调试流动相的比例，确定0.1%磷酸水溶液与甲醇比例是63∶37时，三种目标化合物在C18反相柱上既能获得了良好的峰形和稳定的保留时间，又能与杂质区分开。

色谱柱的选择对本实验的测定有重要影响。本试验分别比较了不同品牌、不同长度的C18反相色谱柱，结果表明，普通C18色谱柱均能将三种目标化合物分开，但与其他几款色谱柱相比，采用Agela Venusil XBP C18(2)色谱柱时，对硝基酚钠、邻硝基酚钠和5-硝基邻甲氧基苯酚钠的出峰时间均较晚，与杂质的分离效果较好，可以有效避免杂质峰的干扰，因此本实验最终确定使用Agela Venusil XBP C18(2)色谱柱。

3.2 检测波长的选择

表1 对硝基酚钠的添加回收率及精密度

表2 邻硝基酚钠的添加回收率及精密度

表3 5-硝基邻甲氧基苯酚钠的添加回收率及精密度

为提高灵敏度，探索最佳检测波长，本试验采用紫外可变波长检测器，分别对样品中对硝基酚钠、邻硝基酚钠和5-硝基邻甲氧基苯酚钠进行扫描，结果见图6～图8。从图中可以看出，对硝基酚钠的最大吸收波长为315 nm，邻硝基酚钠的最大吸收波长为280 nm，5-硝基邻甲氧基苯酚钠的最大吸收波长为340 nm。经过反复试验验证，3种目标化合物在280 nm下都有较大吸收响应，能同时满足三种化合物的测定要求。

3.3 前处理条件的优化

对硝基酚钠、邻硝基酚钠和5-硝基邻甲氧基苯酚钠属于强极性化合物，根据相似相溶的原理，提取溶剂一般都选用极性较强的有机溶剂、缓冲溶液或水和有机溶剂的混合溶液。本实验分别比较了有机溶剂乙腈和甲醇、具有沉淀蛋白作用的1%三氯乙酸水溶液及弱碱性0.1 mol/l碳酸钾溶液作为提取剂的提取效果。结果表明，1%三氯乙酸水溶液提取效率不够高，以甲醇和0.1 mol/l碳酸钾溶液分别作为提取剂，其提取的杂质太多。乙腈与组织的兼容性较好，不仅具有沉淀饲料中蛋白质的作用，还有去除部分脂肪的作用，其提取效果最好。因而，最终选用了乙腈作为提取剂。

图6 对硝基酚钠紫外扫描图

图7 邻硝基酚钠紫外扫描图

图8 5-硝基邻甲氧基苯酚钠紫外扫描图

水产饲料中的蛋白质、脂肪含量较高[15]，因此，实验选择采用正己烷通过液液分离去除乙腈提取液中的脂类杂质。无水硫酸钠可以脱除乙腈提取液中的水分。通过正己烷的净化和无水硫酸钠的脱水作用，不仅可以防止溶液暴沸，还有利于缩短浓缩时间。由于邻硝基苯酚具有挥发性，在浓缩过程中几乎全部损失。因此浓缩时通过在提取液中加入氢氧化钠，使之在碱性溶液中以钠盐的形式存在，可以有效避免邻硝基酚钠的损失。提取液浓缩后呈碱性，目标化合物以钠盐形式存在，无法在C18柱上保留，因此在定容时，通过加入磷酸可以将定容溶液pH值调节至3，从而在色谱柱上有较好的保留。

4 结论

本文采用乙腈提取饲料中的硝基酚钠，正己烷液液萃取除去饲料中的杂质，在碱性条件下减压浓缩至干，通过高效液相色谱仪测定硝基酚钠的含量。经实验结果验证，该方法操作简便，结果稳定可靠，可满足水产饲料中复方硝基酚钠的含量检测。