血凝抑制试验易出现的问题与纠正方法

吴召坤/陕西省丹凤县畜牧兽医中心

本人在兽医实验室工作十余年，最常做的就是血凝抑制试验，血凝抑制试验常用于鸡新城疫、禽流感等疫病的抗体检测与流行病学调查，疫病诊断、防疫监测、免疫程序的制定等工作中，该试验要求操作规范，精心细致，取量精确，判定及时准确，在操作的过程中，稍有失误，就会使试验出现偏差，导致试验失败。本人通过长期的实际工作，总结经验教训，现将试验过程中常出现的问题进行列举，分析，提出纠正方法。

（一）在测定抗原血凝效价时，1～11孔全部百分之百凝集，判定不出抗原效价

原因：抗原效价高，超出血凝板测定范围，解决办法，将抗原做倍比稀释2～3次再测即可。

（二）在测定抗原血凝效价或抗体抑制价时发现红细胞即不被抗原凝集，又不被抗体抑制凝集，1～12孔全部为淡红色

原因：红细胞溶血。解决的办法：重新配制1%的红细胞，正常的1%红细胞悬液静置4～6h后，红细胞沉于溶器底部，上清液清亮透明。

红细胞发生溶血的原因有：

（1）红细胞保存时间太长，超过使用期限。

（2）红细胞悬液冻溶。

（3）PBS液配制不准确。

(三)标准阳性血清的抗体效价误差大于1个滴度

原因1：4个血凝单位抗原配制不准确，4单位抗原要现用现配，混合均匀，配好的抗原室温下放置不超过4h，不可反复冻融。为了防止4单位抗原配制不准确，在作血凝抑制试验前必须作回归试验来测定4单位抗原是否准确。方法是：在血凝板的1～4排1～5孔各加0.025mlPBS 液，取配好的 4 单位抗原0.025ml加入反应板的第一孔内，混匀后吸取0.025ml加入第二孔，依次倍比稀释至第4孔，从第4孔吸取0.025ml弃去，第5孔做对照，1 ～ 5 孔 各 加 0.025mlpbs液，1～5孔各加1%红细胞悬液，震荡混匀，20℃～25℃静置40min后观察结果，若1～2孔红细胞完全凝集，3～4孔不凝集，则说明4单位抗原配制准确，否则需重新测定抗原效价，配制4单位抗原，并作回归试验。直至结果准确。

原因2：阳性对照血清效价降低，阳性对照血清经反复冻融，长期保存或保存不当，就会使抗体效价降低，因此，阳性对照血清不可反复冻融，若要长期保存必须保存在－15℃以下，不得超过保质期。

(四)结果出现慢

原因：环境温度过低，如果环境温度低于20℃时，结果就会出现慢，需延长时间才能出现结果，因此在作试验时应将环境调到20℃～25℃。

(五)结果出现快，而且整板无凝集

当试验环境温度超过30℃时，反应速度加快，试验结果出现快，往往在20min左右就可读数，一旦时间过长，结果就会消失，使整板无凝集现象，会误认为抗体滴度为10log2。因而要求试验温度应控制在20℃～25℃之间，反应40min及时读数判定，不可长时间拖延读数时间。

（六）整板无红细胞凝集现象

当试验环境温度在20℃～25℃时，经40min，整板无凝集，整板无红细胞凝集现象有以下四种可能：一是8份血清抗体滴度均为10log2，二是试验过程中全板少了加4单位抗原步骤。三是4单位抗原已失效。四是环境温度过高，反应速度加快，读数时间拖延。

如果整板无红细胞凝集现象时，首先要查明原因，方法是用微量移液器吸取每孔内的混悬液，当每孔内的混悬液容量为0.075ml时，可能是一、三、四项原因。当每孔内的混悬液容量为0.05ml时，可能是第二项原因。因而要对试验过程仔细分析，查明原因。无论那种原因引起的全板无凝集现象，都必须重新检测，如果是第三项原因引起的，要重新配制4单位抗原，注意操作过程中专心细致，随时检查操作过程是否漏掉了某些步骤，规范操作，控制好试验过程中的环境温度，及时判定结果。

（七）八份被检样品的抗体效价均为 1log2

原因1：可能8份被检血清加后未进行倍比稀释，这种情况一般发生在使用八通道移液器时遗漏了将被检血清作倍比稀释这一环节，第一孔由于抗体滴度高发生全部抑制凝集，而2～11孔无抗体，则完全凝集（第11孔为抗原对照孔）。原因查找：用微量移液器吸取第一孔混悬液，若容量为0.1ml，而2～10孔混悬液均为0.075ml，即为这一原因造成。

原因2:当排除原因1后，也可能8份被检血清抗体效价均为1log2，这种情况很少发生。

在作试验的过程中，一定要严格按照操作规程，规范操作，仔细专心，避免打岔干扰，从使用器具的清洗消毒到试剂的配制，以及试验操作过程的每个步骤都要认真细致，不能马虎，做到科学、认真、准确，才能把试验做的更精确，无误差，正确指导动物疫病防控工作。