用基因芯片技术筛选人子宫内膜癌细胞株中紫杉醇耐药相关基因

林凤，郑君，周友珍(首都医科大学附属北京世纪坛医院，北京100038)

用基因芯片技术筛选人子宫内膜癌细胞株中紫杉醇耐药相关基因

林凤，郑君，周友珍
(首都医科大学附属北京世纪坛医院，北京100038)

摘要:目的应用基因芯片技术筛选人子宫内膜癌细胞株中获得性紫杉醇(TAX)耐药相关基因。方法采用大剂量间歇诱导法，用TAX反复冲击诱导培养人子宫内膜癌Ishikawa细胞株，建成Ishikawa/TAX耐药株。应用Affymetrix Human Genome U133 Plus2.0表达谱芯片检测Ishikawa/TAX与Ishikawa细胞株基因。通过Gene Ontology (GO)聚类分析对差异表达的基因予以分类。采用qRT-PCR对部分差异表达的基因进行验证。结果与Ishikawa细胞相比，Ishikawa/TAX细胞中有110条基因表达有显著性差异(ratio比值＞3)，包括87个上调基因、23个下调基因，GO分类涉及细胞信号传导和调控、细胞黏附分子、细胞代谢及转录调控等;其中上调最明显的基因为S100A12，其次有CYP1B1、FUBP1、CEACAM6，下调基因有TNFAIP3、CD(44)、DKK1等。qRT-PCR检测S100A12、CYP1B1在耐药细胞中高表达，TNFAIP3、CD(44)在耐药细胞中低表达，与基因芯片结果一致。结论采用基因芯片技术筛选出的人子宫内膜癌获得性TAX耐药相关基因的上调基因有S100A12、CYP1B1、FUBP1、CEACAM6，下调基因有TNFAIP3、CD(44)、DKK1。

关键词:基因芯片技术;子宫肿瘤;子宫内膜癌;紫杉醇;耐药基因

子宫内膜癌是妇科最常见的恶性肿瘤之一，化疗是子宫内膜癌主要的辅助治疗手段，用于晚期、复发和早期高危患者。以紫杉醇(TAX)为基础的联合化疗是治疗子宫内膜癌的一线化疗方案，但随着用药时间延长，化疗耐药的产生将导致治疗失败［1，2］。了解TAX耐药机理，对逆转耐药以保证化疗的有效性和患者长期生存具有重要意义。本研究通过大剂量冲击方法建立了人子宫内膜癌TAX耐药细胞株(Ishikawa/TAX)，应用高通量的Affymetrix Human Genome U133 Plus2.0基因芯片，比较耐药细胞与敏感细胞之间基因谱表达的变化，旨在筛选出与子宫内膜癌TAX耐药最为相关的基因，了解其耐药机制，为临床逆转耐药提供实验依据。

1　材料与方法

1.1药品与试剂TAX(批号: 050501)购自海南海药股份有限公司。RNA提取试剂盒、RealqPCR Master Mix购自Exprogen公司; M-MLV逆转录酶、dNTP Mix、MgCl2购自Promega公司; RPMI1640培养基购自Gibco公司; RNA酶抑制剂、DTT、基因芯片及杂交试剂购自Affymetrix公司; TaqDNA聚合酶、real-time PCR试剂盒购自TaKaRa公司; Primers购自Invitrogen公司;小牛血清购自北京鼎国生物有限公司。

1.2Ishikawa/TAX耐药细胞株的构建及鉴定人子宫内膜癌细胞株Ishikawa(由Nishida等1985年建株，北京大学人民医院妇产科魏丽惠教授馈赠，本实验室传代保存)均培养在含10%小牛血清的RPMI1640培养基中，含2 mmol/L谷氨酰胺、100 U/mL青霉素、100 μg/mL链霉素，置于37℃、5% CO2培养箱中培养。加入浓度为300 μg/mL的TAX作用2 h，PBS洗3遍，用普通培养液继续培养，待细胞密度达70%～80%时传代1次，同法进行第2次处理。如此反复处理13次，历时8个月建成Ishikawa/TAX耐药细胞株。MTT法检测其耐药性，计算耐药指数。Ishikawa/TAX的群体倍增时间(Td)为(30.41±2.89) h，半数致死浓度(IC50)为(14.674±0.326)μg/mL; Ishikawa细胞Td为(20.56±2.67) h，IC50为(2.81±0.346)μg/mL，其耐药指数为5.23 ±0.49，属于中度耐药。撤药培养2个月后复测IC50不变;细胞冻存3个月后复苏，其耐药性稳定。取对数生长期Ishikawa及Ishikawa/TAX细胞，按TRIzol一步法抽提细胞总RNA，QIAGEN RNeasy Kit进一步纯化总RNA，采用琼脂糖凝胶电泳法测定总RNA含量，RIN鉴定RNA完整性。琼脂糖凝胶电泳显示28 S、18 S两条带清晰，无拖尾现象，表示RNA完整性良好，符合基因芯片标准。

1.3基因芯片的制备及相关基因检测由RNA合成双链DNA，以Oligo dT Primer为引物反转录合成第二链cDNA，然后经体外转录生成标记有生物素的cRNA，纯化的cRNA片段化为35～200 bp的小片段，再与Affymetrix Human Genome U133 Plus 2.0芯片杂交，反复洗涤后染色，用GeneChip®Scanner 3000扫描芯片的荧光信号图像。用基因芯片操作软件GCOS1.2对图像进行数据定量处理和分析，差异基因的筛选标准为T检验P＜0.05且差异倍数＞2。根据Gene Ontology(GO，http://www.geneontology.org)及Netaffy(http://www.affymetrix.com)对基因的注释，对差异显著的基因按照分子功能、细胞组分及生物学行为进行分类，再按生物学行为做GO聚类分析，并在GenBank中明确其功能。

1.4差异表达部分基因的mRNA检测采用qRTPCR进行验证。根据GenBank人类基因的cDNA序列，应用引物设计软件Primer5.0设计引物，引物由美国Invitrogen公司合成。提取细胞总RNA，逆转录为cDNA，行PCR及预实验，2%琼脂糖凝胶电泳检测PCR产物在100 bp附近有扩增条带，证明为阳性。再行SYBR GREEN real-time PCR检测。取定量PCR专用的96孔板，每孔加入cDNA 1 μL、RealqPCR Master Mix 12 μL、引物F/R(上下游引物的终浓度各为15 pmol/μL) 0.5/0.5 μL，用双蒸水补足体系至25 μL，封膜，用ABI7900HT定量PCR仪进行检测。PCR反应条件:先50℃、2 min，95℃、10 min;然后95℃、15 s，60℃、1 min，共40个循环(生成扩增曲线) ;最后95℃、15 s，60℃、15 s，95℃、15 s(生成溶解曲线)。记录每个反应管中的荧光信号到达所设定的域值时所经历的循环数，即Ct值。利用管家基因对目的基因的表达进行校正，得出相对定量结果。每次反应均做3个复孔，Ct值取其均值。以18 S作为内参照，同时以亲代细胞Ishikawa作为基准，Ishikawa/TAX耐药细胞mRNA的表达量表示成亲代细胞的N倍。N=2－ΔΔCt，样品Ct－基准Ct=(Ct样品－Ct样品18S)－(Ct基准－Ct基准18S)。

1.5统计学方法采用SPSS11.0统计软件。计量资料以珋x±s表示，采用t检验。P＜0.05为差异有统计学意义。

2　结果

共筛选出1 400余条差异基因。通过提高筛选标准(ratio值＞3)同时去除转录本重复及功能尚未明确的基因后，发现Ishikawa/TAX耐药细胞与Ishikawa细胞之间有110条基因差异显著，其中87条在耐药株中上调，23条在耐药株中下调。110条差异基因的生物学功能主要集中在细胞信号转导及调控、细胞黏附、细胞代谢及转录等几个方面。通过对筛选出的基因进一步分析，挑选出了7条与耐药关系最密切的基因(详见表1)。其中，Ishikawa/TAX耐药细胞株中S100A12和CYP1B1的mRNA表达分别是Ishikawa细胞的39.397倍、2.497倍，TNFAIP3、CD44的mRNA表达是Ishikawa细胞的0.473倍、0.902倍，两者比较，P均＜0.05。结果与基因芯片一致，该基因芯片结果的可信性高。

3　讨论

TAX化疗耐药的产生机制可能是一个多基因、多因素、多步骤的复杂生物过程，涉及肿瘤细胞、机体、靶组织的相互影响和作用，涉及一系列肿瘤相关基因的调节和信号传导。基因芯片技术具有高通量、大规模、高灵敏性、高度自动化和重复性的特点，是寻找耐药相关基因以及了解各基因之间复杂的相互调控关系的最好方法［3］。人类全基因组Affymetrix Human Genome U133 Plus2.0表达谱芯片包括人类全基因组47 000个转录本，代表了38 500个明晰的人类基因，其强有力的探针集以及一个转录本有多重独立探针检测，提供了最大的准确性和重复性，是目前研究肿瘤的发生发展和化疗耐药机理最有效的方法。能帮助我们从分子水平全面了解肿瘤耐药机制，寻找肿瘤耐药标志物，发掘肿瘤耐药的基因治疗的有效靶点，对肿瘤的早期诊断、个体化治疗、预后判断等有其他方法不可比拟的优势［4，5］。

本实验通过该芯片技术检测了子宫内膜癌TAX耐药细胞Ishikawa/TAX与敏感细胞之间的基因表达谱，发现有110条基因差异显著，其中87条在耐药株中上调、23条在耐药株中下调。根据GO 及Netaffy对基因的注释，再对这些基因进行分子功能及生物学行为GO聚类分析，发现差异表达基因分别属于多个分子功能家庭，参与多个生物过程。通过对筛选出的基因进一步分析，发现有7个差异表达基因可能参与了Ishikawa/TAX细胞的耐药机制，其中上调最明显的基因为S100A12，其次为CYP1B1、FUBP1、CD66c;明显下调的基因有TNFAIP3、CD44、DKK1。其编码蛋白涉及细胞信号传导和调控、细胞黏附及氧化还原反应等。我们选择了涉及NF-κB信号通路基因S100A12、TNFAIP3及细胞黏附分子CD44、CYP1B1基因进行了进一步的验证，结果与芯片一致。

NF-κB是一种重要的细胞核转入因子，除了参与炎症、免疫、细胞分化及凋亡等生理功能外，还与肿瘤发生、发展、浸润及化疗耐药有关［6］。化疗药物激活NF-κB/IκB信号通路是产生诱导性耐药的重要机制。NF-κB/IκB信号通路的过度活化，是导致卵巢癌耐药细胞COC1/DDP对顺铂耐药的重要原因之一。Ⅱ型子宫内膜癌的化疗耐药也与高水平的Nrf2密切相关［7］。S100A12是近年发现的S100蛋白家族成员之一，通过正向调控NF-κB的级联反应发挥促炎、调节免疫反应、抗微生物等生物学功能。关于S100A12与化疗耐药的关系尚未见报道。TNFAIP3又称锌指蛋白A20，是一种具有抗细胞凋亡及抑制NF-κB活化双重功能的胞液蛋白。在耐药细胞株中，TNFAIP3的持续低表达可能通过激发RIP依赖的信号级联反应从而调控NF-κB介导的细胞生存，降低细胞凋亡水平，导致肿瘤细胞产生耐药。本实验发现，S100A12在Ishikawa/TAX耐药株中表达上调最明显，TNFAIP3在耐药株中表达明显下调，推测S100A12、TNFAIP3基因可能通过调控NF-κB信号通路及细胞凋亡，在子宫内膜癌对TAX的获得性耐药中起主要作用。

CYP1B1基因为CYP1B1亚族的惟一成员，与其他P450酶不同，其在正常组织中不表达或表达水平很弱，但在子宫内膜癌、乳腺癌、前列腺癌等多种肿瘤组织中表达过量［8，9］。CYP450是体内重要氧化还原酶系，可以催化众多的内源性物质如脂肪酸、类固醇激素、外源性物质和进入体内的药物的代谢，使药物失活加速。Martinez等［10］研究发现，TAX是p糖蛋白外排转运的底物，主要通过细胞色素P450酶代谢。CYP1B1基因mRNA和蛋白的表达量在一定程度上能够反映卵巢癌细胞对TAX的敏感性，可能由于高表达的CYP1B1酶增加了对TAX的代谢而导致耐药。本实验发现CYP1B1在Ishikawa/TAX耐药株中上调最明显，提示它可能通过氧化还原反应调节TAX耐药。

CD44是一种细胞表面跨膜糖蛋白，其正常功能是作为透明质酸受体参与细胞—细胞、细胞—基质之间的特异性黏附过程。CD44与宫颈癌、乳腺癌、胃癌等多种恶性肿瘤的发生、发展、浸润及转移关系密切。Zieker等［11］报道，CD44表达下调可导致多细胞团簇化疗耐药。CD44和抑制凋亡蛋白Bcl-2表达呈负相关，而BcL-2家族蛋白持续高表达又是引起多细胞团簇化疗耐药的原因。本实验结果显示，在耐药株中CD44表达明显下调，提示细胞黏附分子参与了TAX的获得性耐药过程，与文献报道一致。

子宫内膜癌TAX化疗耐药是一个多基因、多环节、多途径参与的过程，可能涉及影响不同生化途径的多群遗传因子表达的改变。本实验利用基因芯片技术，通过生物信息学分析数据的方法，筛选和鉴定了子宫内膜癌TAX获得性耐药细胞Ishikawa/TAX的基因表达谱。为进一步研究TAX耐药的分子机理、寻找逆转耐药的靶点和方法提供了线索。

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·基础研究·

Application of gene chip technology for screening and identifying taxol-resistant related genes in human endometrial carcinoma cell line

LIN Feng，ZHENG Jun，ZHOU You-zhen
(Beijing Shijitan Hospital of Capital Medical University，Beijing 100038，China)

Abstract:Objective To screen and identify the acquired taxol (TAX) -resistant related genes in human endometrial carcinoma cell line by applying gene chip technology.Methods We established the Ishikawa/taxol (TAX) -resistant cell line by intermittent and repeated exposure to TAX of a high concentration on the human endometrial carcinoma cell line Ishikawa.The genes of Ishikawa/TAX and Ishikawa cells were examined by using Affymetrix Human Genome U133 Plus2.0 expression profile chip.The differentially expressed genes were classified by Gene Ontology (GO) cluster analysis.Realtime quantitative PCR (qRT-PCR) was performed to confirm part of the differentially expressed genes.Results Compared with Ishikawa cells，there were 110 significantly differential expression genes in Ishikawa/TAX cells (ratio＞3)，of which the up-regulated and down-regulated genes were 87 and 23，respectively.The classification of GO involved the cell signal transduction and regulation，cell adhesion molecule，cell metabolism and transcription regulation，etc.S100A12 was upregulated significantly，followed by CYP1B1，FUBP1 and CEACAM6.TNFAIP3，CD(44)and DKK1 were significantly downregulated.The qRT-PCR showed that S100A12 and CYP1B1 was highly expressed in the drug-resistant cells，and TNFAIP3 and CD(44)was lowly expressed in the drug-resistant cells，which coincided well with the results of cDNA microarray.ConclusionGene chip technology screens that the up-regulated genes of acquired TAX-resistant related genes in human endometrial carcinoma cell line are S100A12，CYP1B1，FUBP1 and CEACAM6，and the down-regulated genes are TNFAIP3，CD(44)and DKK1.

Key words:gene chip technology; uterine neoplasms; endometrial carcinoma; paclitaxel;drug-resistant gene

(收稿日期:2015-02-19)

通信作者简介:周友珍(1965-)，女，主任医师，研究方向为妇科恶性肿瘤化疗耐药及逆转。E-mail: bjzhouyouzhen@163.com

作者简介:第一林凤(1986-)，女，住院医师，研究方向为妇科恶性肿瘤化疗耐药。E-mail: linfeng5698@ sina.com

文章编号:1002-266X(2015) 19-0021-04

文献标志码:A

中图分类号:R737.31

doi:10.3969/j.issn.1002-266X.2015.19.007