抗M2受体自身抗体对家兔心房电生理特性的影响

洪昌明，郑强荪，刘雄涛，王洪涛，王彬，姜文瑞(中国人民解放军总医院，北京00853;第四军医大学附属唐都医院)

抗M2受体自身抗体对家兔心房电生理特性的影响

洪昌明1，郑强荪2，刘雄涛2，王洪涛2，王彬2，姜文瑞2
(1中国人民解放军总医院，北京100853;2第四军医大学附属唐都医院)

摘要:目的探讨抗M2受体自身抗体对家兔心房电生理特性的影响。方法通过静脉注射合成多肽制备抗

M2受体自身抗体阳性家兔模型，在离体灌注下检测心房有效不应期、房内传导时间、窦房结恢复时间和心房重复反应，并进行心房颤动(房颤)的诱发。结果抗M2受体自身抗体阳性家兔心房有效不应期缩短，有效不应期频率适应性降低，房内传导时间延长，心房重复反应增多，窦房结恢复时间延长，房颤诱发率增高。结论抗M2受体自身抗体能改变家兔心房电生理特性，有利于房颤的发生。

关键词:m2受体;自身抗体;心房颤动;离体灌流

抗M2受体自身抗体是近年在扩张型心肌病、高血压、Chagas心肌病、甲状腺功能亢进症等患者中发现的一种自身抗体［1～4］。研究［5］显示，抗M2受体自身抗体阳性的扩张型心肌病患者心房颤动(房颤)发病率明显增高，在部分被认为是孤立性房颤患者中亦可检出抗M2受体自身抗体。抗M2受体自身抗体的存在可能改变了心房肌的电生理特性，从而促进房颤的发生。但抗M2受体自身抗体对心房电生理特性有何影响目前尚不清楚。本试验

拟通过建立抗M2受体自身抗体阳性家兔模型，观察抗M2受体自身抗体对心房电生理特性的影响。

1　材料与方法

1.1材料新西兰大白兔30只，体质量2.5～3.5 kg，正常喂养。主要仪器与试剂:离体心脏灌流装置(美国Radnoti公司)、64导多导电生理记录仪(中国华南医电公司)、4极记录电极(美国EP公司)、戊巴比妥和弗氏佐剂均购自美国Sigma公司。

1.2造模及分组按照人M2受体细胞外第二环

功能表位肽段(169～193位)氨基酸序列，由西安蓝晶公司合成多肽，25个氨基酸的序列为: V-R-T-VE-D-G-E-C-Y-I-Q-F-F-S-N-A-A-V-T-F-G-T-A-I。将多肽与载体蛋白——匙孔血蓝蛋白(KLH)连接，使其成为同时具有免疫原性和免疫反应性的大相对分子质量完全抗原。将连接好的半抗原-载体蛋白混合物与等体积佐剂(第1次免疫使用完全弗氏佐剂，第2次及以后使用不完全弗氏佐剂)充分混合，使其完全乳化。采用常规微量多次免疫法免疫家兔，背部皮下多点注射。2周后进行第2次免疫，以后每4周免疫1次，共7次。每次免疫后1周，采耳缘静脉血检测抗体效价。间接ELISA法检测结果显示，多肽-KLH免疫后4周，动物可检出抗体阳性，此后实验动物稳定表达抗体，纯化抗体的最高效价可达1∶16 000，造模成功。将30只白兔分为实验组与对照组各15只，实验组(M2组)为通过注射免疫6个月以后的动物，均经ELISA实验证实体内长期、稳定表达抗M2受体自身抗体。对照组为正常新西兰大白兔，与实验组同时开始饲养。

1.3离体心脏灌流预热离体灌流系统至37℃，用95% O2+ 5% CO2混合气体对台氏液进行氧饱和。兔称重后，通过耳缘静脉注射3%戊巴比妥溶液麻醉(30mg/kg)，腹腔注射肝素1 000 U/kg。正中开胸，快速离断各主要血管，迅速将心脏连同一段主动脉(保留至少1 cm)取出，在冰台式液中停跳。迅速剪开心包膜并剪去心脏周围的气管、肺组织等，在主动脉根部穿一根线备用。将主动脉套进心脏插管口内，用丝线将主动脉和心脏插管结扎在一起并固定。待心脏复跳、稳定后，将电极置于心房表面:左、右心耳各置一块片状电极，无关电极置于主动脉根部。连接多导电生理仪、刺激仪。

1.4测量指标①心房有效不应期(AERP)和AERP频率适应性:测量AERP时将片状记录电极固定于心耳，刺激针位于同侧心耳另一端。AERP:采用心脏程序期前刺激法测量AERP，分别以S1S1 =300ms、S1S1 = 250ms的基础周长进行S1S2扫描，S1∶S2 =8∶1，S1S2以10ms递减，到不应期后延长10ms，5ms递减，不能夺获心房的最长S1S2间期为AERP，测量3次取均值。以(AERP300-AERP250)/ 50ms作为AERP频率适应性的判断指标。②房内传导时间:将刺激电极置于右心耳近上腔静脉处(靠近窦房结)，记录电极置于左心耳。右心耳刺激电极发放300ms的刺激信号，测量刺激信号传到左心耳电极所需要的时间。③心房重复反应(RAR):刺激电极置于右心耳，记录电极置于左心耳，S1S1 =300ms，进行S1S2扫描，S1∶S2 = 8∶1，S1S2以10ms递减，直至不应期。观察记录S2后的心房电位，以每一个向上的心房电位作为1个RAR，计总数。将每只兔在实验中诱导出的最大RAR数作为该兔的RAR值。④窦房结恢复时间(SNRT)及校正的窦房结恢复时间(CSNRT):以SNRT和CSNRT作为评定窦房结功能的指标。将起搏电极和4极记录电极置于右心耳。用较自身频率快20 ppm的频率起搏心房，每次刺激30 s后，停60 s;再按每次递增20 ppm的频率进行下一次刺激，一直持续到SNRT不再延长或起搏频率已增至200 ppm。SNRT:从每一次刺激的最后一个脉冲信号开始，至恢复的第一个窦性p波开始之间的时距即为SNRT。CSNRT: CSNRT = SNRT－PP间期。⑤房颤诱发率:采用分级递增的Burst刺激方法。初始刺激为波长100ms的Burst刺激，持续时间2 s，依次减低波长5ms，直至减至60ms;诱发出的房颤定义为持续时间大于2 s的快速不规则心房电活动。若一次刺激不能诱发出定义中的房颤，则再重复刺激一次。若两次刺激中诱发出一次持续大于2 s的房颤，则该动物为可诱发房颤动物;若两次刺激完成后仍未诱发出持续大于2 s的房颤，则该动物为不可诱发房颤动物，不再进行刺激。

1.5统计学方法采用SPSS15.0统计软件。计量资料以珋x±s表示，组间比较采用t检验，率的比较采用χ2检验。P＜0.05为差异有统计学意义。

2　结果

2.1抗M2受体自身抗体对AERP和AERP频率适应性的影响S1S1 = 300ms时，M2组与对照组AERP分别为(62.1±8.3)、(83.9±7.5)ms AERP频率适应性分别为0.09±0.05、0.17±0.07，两组比较，P均＜0.05。

2.2抗M2受体自身抗体对房内传导时间的影响

M2组与对照组的房内传导时间分别为(23.9± 2.6)、(17.4±2.3)ms，两组比较，P＜0.05。

2.3抗M2受体自身抗体对RAR的影响M2组在早搏刺激后出现了一连串快速、不规则、碎裂的心房电活动，类似于一次很短暂的房颤发作。M2组与对照组RAR数分别为(18.5±9.4)、(2.1±1.1)次，两组比较，P＜0.01。

2.4抗M2受体自身抗体对SNRT和CSNRT的影响M2组、对照组的SNRT分别为(441.0± 48.8)、(384.8±31.8)ms，CSNRT分别为(134.9± 23.3)、(98.4±17.6)ms，两组比较，P均＜0.05。

2.5抗M2受体自身抗体对房颤诱发的影响M2

组有11个离体心脏(11/15)诱发出持续时间大于2 s的房颤，而对照组仅有2个离体心脏(2/14，1个心脏未能完成实验)诱发出持续时间大于2 s的房颤。两组房颤诱发率比较，P＜0.05。

3　讨论

Fu等［1］首次报道了在扩张型心肌病患者血清中存有抗M2受体自身抗体。这种自身抗体可特异性地识别M2受体细胞外第二环上的169～193氨基酸序列的表位肽段，与以此肽段为抗原经家兔免疫制成的多克隆抗体有相同的免疫和功能特性［6，7］。本实验采用Langendorff离体心脏灌流装置进行电生理实验，尽量减少自身自主神经系统张力对实验结果的干扰。Baba等［5］调查发现，M2受体自身抗体的存在与扩心病患者房颤的高发病率有关。在扩心病患者中，抗M2受体自身抗体阳性者比阴性者心房颤动更多见。除了年龄和血浆ANP水平外，抗M2受体自身抗体阳性是心房颤动发生的最强独立预测因素。本研究结果发现，抗M2受体自身抗体阳性动物AERP显著短于正常对照，有效不应期频率适应性下降;房内传导时间长于正常对照;早搏刺激诱发出更多的心房重复反应; SNRT 和CSNRT均显著延长; Burst刺激更易诱发出房颤。

M2受体自身抗体对心房造成的这些影响与其作为M2受体激动剂的生物学作用有关［3，8］。抗M2受体自身抗体可产生激动剂样反应［3］。阻断异丙肾上腺素刺激引起的L型钙离子流，并能随滴度增加而缩短动作电位时程［3，8］。APD的缩短导致了AERP的缩短，加上传导速度的减慢，为多子波折返提供了条件［9］，而不应期频率适应性的下降则有助于房早触发房颤。近年来迷走神经在心房颤动发病机制中的作用日益得到重视［10，11］，抗M2受体自身抗体的M2受体激动剂样作用与迷走神经激活作用一致。心房易损性指心房是否易于诱发心律失常。RAR是衡量心房易损性的一个指标。心房的相对不应期比心房的有效不应期一般长10～30ms，相对不应期与有效不应期间的这段时间又称为心房易损期，给予期前刺激可诱发反复的心房激动，记录这些反复的心房激动次数即为RAR。这种反复的心房激动可能变成持续性，并可能导致房扑或房颤的发生。RAR越多，说明早搏越易引起心房的反复激动，即心房易损性增加，易于发生房性心律失常。本实验发现，在早搏刺激后出现了一连串快速、不规则、碎裂的心房电活动，类似于一次很短暂的房颤发作。进一步分析发现，抗M2受体自身抗体阳性动物RAR比正常对照显著增加，说明抗M2受体自身抗体阳性动物的心房易损性增加，早博刺激更易引起心房的反复激动，增加了发生房颤的可能性。而使用Burst刺激诱发房颤的实验结果进一步直接证实了M2受体自身抗体阳性的动物更易诱发房颤。

本研究结果提供了抗M2受体自身抗体影响心房电生理特性的直接证据。抗M2受体自身抗体阳性动物的AERP缩短、AERP频率适应性下降、房内传导时间减慢，为房颤的发生提供了基础; RAR的增多说明心房易损性增加; Burst刺激诱发房颤实验则直接证明抗M2受体自身抗体阳性动物更易于发生房颤。

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·临床研究·

收稿日期:( 2015-04-13)

文章编号:1002-266X(2015)33-0032-03

文献标志码:A

中图分类号:R541

doi:10.3969/j.issn.1002-266X.2015.33.011