外周血单核细胞miRNA-146a与冠状动脉病变复杂性的关系

陈丽媛，符春晖，严华，陆永光，黄军章

(钦州市第二人民医院，广西钦州535000)

近年来研究发现，miRNAs在包括细胞内信号转导、动脉粥样硬化以及肿瘤等多种生物学和疾病过程中发挥重要作用［1～4］。研究发现，miR-146a 在炎症、免疫相关的疾病中均明显上调，且与动脉粥样硬化性疾病密切相关［5，6］。因此，miR-146a 可能作为一种有临床诊断价值的炎症因子，为动脉粥样硬化性疾病的诊断提供新的方法。到目前为止，国内外研究尚无miR-146a与冠状动脉病变复杂程度之间相关性的研究。因此，本研究首次对miR-146a与SYNTAX积分之间的相关性进行探讨，以期找到新的预测冠状动脉病变复杂性的诊断因子，为冠心病的诊断及预后评价提供新的方法和思路。

1 资料与方法

1.1 临床资料 2012年3月～2013年12月钦州市第二人民医院心血管内科住院接受冠状动脉造影术的患者90例，其中男47例、女43例，年龄(62.04±8.12)岁。根据临床资料及造影结果将所有纳入患者分为冠脉正常组、稳定性心绞痛组、急性冠脉综合征组，各30例。排除标准:①全身各系统急、慢性感染;②严重肝肾功能不全;③风湿性疾病;④自身免疫性疾病;⑥既往行血运重建术;⑦主动脉夹层;⑧心包炎。本研究符合人体试验伦理学标准，并得到伦理委员会的批准以及患者知情同意。

1.2 方法

1.2.1 标本采集 入院次日早晨空腹情况下，采集患者外周静脉血4 mL，肝素钠抗凝，Ficoll法分离外周血单个核细胞，PBS洗涤，－80℃储存待检。

1.2.2 miR-146a检测 采用 Real-time PCR法检测miR-146a，严格按照总RNA提取试剂盒(德国QIAGEN公司)说明书进行RNA提取。取总RNA 10 μL，DEPC 水 2.5 μL，10 mmol/L dNTP 2.0 μL，RNase抑制剂 0.5 μL，miR-146a 逆转录引物 0.5 μL，cel-miR-146a逆转录引物 0.5 μL，5 × buffer 5.0 μL，M-MLV 1.0 μL，配成总体系后混匀 42 ℃孵育。将获得的 cDNA按1∶20稀释，取5 μL;2×SYBR Green PCR Master Mix 10 μL，PCR Reverse primer 0.5 μL，PCR forward primer 0.5 μL，双氧水4 μL混匀。按照95℃ 5 min→95℃ 15 s→65℃ 15 s→72℃ 32 s进行40个循环。结果以PCR管内荧光信号达到最低可检测值时所经历的循环数C(T)值表示。miR-146a与内参 U6的相对表达量用2－ΔΔCT表示。

1.2.3 冠状动脉造影检查 所有纳入患者在住院期间完成冠状动脉造影检查，给予至少4个体位观察左冠状动脉病变情况，至少2个体位观察右冠状动脉病变情况。冠状动脉病变情况通过SYNTAX积分［7］进行评价。冠状动脉病变定义为直径≥1.5 mm的血管目测的管腔直径狭窄≥50%的病变。每个病变给予相应积分，总的SYNTAX积分即为所有病变积分的总和。冠状动脉造影最终结果和总SYNTAX积分由我科两个高级职称医师进行评价并通过协商达成一致结论，最终计算并记录所有患者的SYNTAX积分。

1.2.4 统计学方法 采用SPSS19.0统计软件。计量资料用±s表示，多组间比较采用One-way ANOVA分析，如果组间方差不齐，则采用Welch法进行组间比较，组间多重比较采用Dunnetts'T3检验，相关性分析采用Spearman相关分析。以P＜0.05为有统计学差异。

2 结果

2.1 各组mirRNA-146a RNA比较 冠脉正常组、稳定性心绞痛组、急性冠脉综合征组miR-146a相对表达量分别为 2.50 ± 0.85、2.84 ± 1.06、4.31 ±1.85，P ＜0.01。根据 SNYTAX 积分，进一步将冠心病患者分为低分组(＜23分)和高分组(≥23分)，高分组miR-146a相对表达量明显高于低分组(4.92±1.41 vs 2.86 ±0.91，P=0.026)。

2.2 相关性分析 对miR-146a RNA相对表达量与SYNTAX积分进行相关性分析，结果显示，miR-146a相对表达量与SYNTAX积分呈正相关(r=0.588，P ＜0.01)。

3 讨论

研究发现，与稳定性冠心病患者相比，急性冠脉综合征患者的外周血单核细胞中miR-146a表达明显升高，且与血浆 TNF-α呈正相关［8］。在本研究中，与冠脉正常组、稳定性心绞痛组比较，急性冠脉综合征患者外周血单核细胞中miR-146a相对表达量明显升高，提示mic-146a参与的炎症调控机制可能在动脉粥样硬化斑块不稳定中发挥作用。

SYNTAX积分是一种对冠状动脉病变严重程度进行分层的有效方法。研究证实，随着SYNTAX积分增加，冠心病患者再次血运重建及远期不良心脏事件增加［7］。因此，本研究中将SYNTAX积分作为冠状动脉病变严重程度的指标。在进一步对miR-146a的研究发现，SYNTAX积分高的患者，miR-146a相对表达量明显升高，且与SYNTAX积分呈明显的正相关性，提示miR-146a可能对外周血管疾病的评价具有一定的临床意义。本研究的创新之处在于首次探讨并发现miR-146a与冠状动脉病变的复杂性之间存在明显相关性，提示miR-146a在冠状动脉粥样硬化发生、发展中发挥调控作用，且有可能作为诊断工具应用于临床，指导冠心病患者的危险分层及预后评价。不足及局限之处在于，本研究仅仅在miR-146a与冠状动脉病变之间的相关性进行了简单分析，对其潜在的调控机制未进行深入研究。此外，由于样本量的限制，本研究并没有进一步对miR-146a诊断冠状动脉病变复杂性的特异性及敏感性进行分析。

在今后的工作中，我们将通过在体动物实验对miR-146a在动脉粥样硬化中的机制进行探讨。同时在临床研究中，通过纳入更多的患者进行诊断及随访，以进一步评价miR-146a对冠状动脉病变复杂程度的诊断价值及提供更多的预后信息。

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