胎膜早破产妇胎膜组织中TRAIL、MMP-2基因及蛋白表达变化

崔世红，陈娟，孙俊燕，程国梅，杭中霞，李园园

（郑州大学第三附属医院，郑州 450052）

胎膜早破即临产前胎膜发生破裂，是产科常见的合并症，发病率呈逐年上升趋势［1］。胎膜早破发病机制较复杂，目前认为主要与感染、凋亡有关。肿瘤坏死因子相关凋亡配体（TRAIL）能通过与其相应的受体结合启动细胞内死亡受体通路，可特异性地在体内迅速诱导细胞凋亡。基质金属蛋白酶（MMPs）可降解细胞外基质，导致胎膜组织结构溶解，对维持胎膜完整性起重要作用。本研究观察了胎膜早破产妇胎膜组织中TRAIL、MMP-2 mRNA及蛋白的表达变化，探讨TRAIL、MMP-2与胎膜早破发病的关系。

1 资料与方法

1.1 临床资料 2014年6～11月因胎膜早破行剖宫产术结束妊娠的产妇30例（胎膜早破组），年龄（27.6 ±2.9）岁，孕周（38.9 ±1.3）周。随机选取同期剖宫产分娩的健康产妇30例（对照组），年龄（27.4 ±1.1）岁，孕周（39.0 ±1.3）周。均无其他母体疾病、产科并发症，剖宫产指征为胎位异常、骨盆狭窄等。两组产妇年龄、孕周等资料具有可比性。两组胎盘娩出后取胎膜破口处至胎盘边缘的胎膜组织，约1 cm×4 cm，冷生理盐水冲洗表面血迹，使其呈卷状，用大头针固定，分为两部分，一部分放入冻存管后迅速投入液氮，一部分甲醛固定。

1.2 TRAIL、MMP-2蛋白检测 采用免疫组化SP法。TRAIL、MMP-2主要定位于绒毛膜滋养细胞、羊膜上皮细胞的胞质，呈黄棕色或棕褐色染色。根据染色程度及阳性细胞百分比综合进行评分。染色强度评分:无色计0分，淡黄色计1分，棕黄色计2分，棕褐色计3分;无阳性细胞计0分，阳性细胞百分比≤10%计1分，阳性细胞百分比11% ～50%计2分，51% ～75%计3分，＞75%计4分;染色强度与阳性细胞百分比得分相乘，＞3为阳性［2］。

1.3 TRAIL、MMP-2 mRNA 检测 采用 real-time PCR法。采用TRIzol法提取胎膜组织中总RNA，反转录为cDNA，进行实时定量PCR反应，将GAPDH作为内参基因，引物由上海生物工程有限公司合成。TRAIL上游引物序列为 5＇-AGAGGCACCACTAAAAGATCGC-3＇，下游引物序列为 5＇-GGTTTCACTATGTTGGTCACTATGG-3＇，扩增产物 133 bp;MMP-2上游引物序列为5＇-TGACGTGGACATCCGCAAAG-3＇，下 游 引 物 序 列 为 5＇-CTGGAAGGTGGACAGCGAGG-3＇，扩增产物280 bp;GAPDH上游引物序列为 5＇-TCGTGGAAGGACTCATGACC-3＇，下游引物序列为 5＇-AGGGATGATGTTCTGGAGAG-3＇，扩增产物226 bp。PCR反应条件:95℃ 10 min;95℃ 30 s，60 ℃ 1 h，35 个循环，重复 3 次，以 2-ΔΔCt法计算mRNA相对表达量。

1.4 统计学方法 采用SPSS17.0统计软件。计量资料用±s表示，两组比较采用t检验;计数资料比较采用χ2检验。P＜0.05为差异有统计学意义。

2 结果

2.1 两组胎膜组织中TRAIL、MMP-2蛋白表达比较 胎膜早破组胎膜组织中TRAIL表达阳性26例（87%）、MMP-2表达阳性23例（77%），对照组分别为17例（57%）、15例（50%）。两组胎膜组织中TRAIL、MMP-2蛋白阳性表达率相比，P均＜0.05。

2.2 两组胎膜组织中TRAIL、MMP-2 mRNA表达比较 胎膜早破组胎膜组织中TRAIL mRNA相对表达量为1.62 ±0.18、MMP-2 mRNA 相对表达量为1.78 ± 0.54，对照组分别为 0.99 ± 0.17、1.03 ±0.49。两组胎膜组织中 TRAIL、MMP-2 mRNA相对表达量相比，P均 ＜0.05。

3 讨论

细胞增殖/凋亡平衡是胎盘发挥作用的基础。胎膜早破可能是多个基因调控、多种因素相互作用致胎膜细胞凋亡、降解的过程。有学者［3］发现足月妊娠产妇胎膜破裂后绒毛膜、羊膜破裂区附近有许多凋亡细胞，而在远离破裂区仅有少量凋亡细胞，认为细胞凋亡与胎膜早破的发生有关［4］。

TRAIL/TRAIL受体系统参与整个妊娠期间胎盘、胎膜自我环境的稳定［5］。TRAIL是肿瘤坏死因子家族的超家族成员之一。TRAIL共有5种受体，其中 DcR1、DcR2、OPG 为诱骗受体，DR4、DR5 为死亡受体［6］。DR4、DR5与 TRAIL结合后能激活凋亡信号转导途径，通过线粒体途径及死亡受体途径进一步激活含半胱氨酸的天冬氨酸蛋白水解酶（Caspase）级联反应系统，最终引起细胞凋亡。Phillips等［3］发现胎盘、细胞滋养层细胞、巨噬细胞中均存在TRAIL及其受体的转录物。当机体受到内外环境的影响，特别发生感染时，细胞因子分泌增多，上调TRAIL及其受体表达，使TRAIL/TRAIL受体系统平衡被打破，母胎界面免疫平衡发生紊乱，细胞凋亡及MMPs分泌增多，从而导致胎膜早破的发生。MMP-2可在人妊娠期胎膜连续表达［7］，调节胎膜细胞外基质蛋白的分解代谢［8］。而MMP-2过高表达可加剧胎膜中的胶原降解，使胎膜脆性增加，胎膜强度及韧性降低，局部抗张能力下降，导致胎膜早破［9，10］。TNF-α 可增强胎膜组织中 MMPs基因的表达及活性，致使胎膜软化和破裂［11］;炎症因子分泌增多也可诱导或激活MMPs降解细胞外基质，破坏胎膜胶原［12，13］。Sandig 等［14］发现胎膜早破产妇羊膜绒毛膜、胎盘的MMP-2基因的表达和活性增加也进一步证明了这一观点。

本研究结果显示，胎膜早破产妇组胎膜组织中TRAIL、MMP-2蛋白阳性表达率升高，TRAIL、MMP-2 mRNA 表达上调，与相关研究［15，16］结果一致。我们推测，TRAIL、MMP-2表达升高促进滋养细胞过度凋亡和胎膜降解，这可能是胎膜早破发生的重要原因。

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