“泻剂结肠”大鼠模型的制作及其胃肠组织中c-kit mRNA的表达变化

王文革，次苗苗，张俊红，刘兴，孟小雨

(中国人民解放军空军总医院，北京100142)

“泻剂结肠”指长期使用刺激性泻剂造成肠道正常蠕动和排便功能紊乱，最终形成对泻剂的依赖性，无泻剂不排便，是慢传输型便秘(STC)的一种类型，其发病机制尚不清楚，临床缺乏有效治疗方法。Cajal间质细胞(ICC)作为引起胃肠平滑肌自动节律性运动的起搏细胞，在胃肠道运动紊乱性疾病的研究中多有涉及［1］。“泻剂结肠”患者不仅表现为结肠动力降低、粪便干硬、排便时间延长，还常伴有早饱、胃排空障碍、恶心、呕吐、腹胀等上消化道症状，因此有必要研究ICC在全胃肠道中的表达情况。2013年2～6月，我们采用大黄酸粉悬液灌胃建立“泻剂结肠”大鼠模型，并观察了其胃窦、小肠、结肠组织中ICC的特异性标志物酪氨酸激酶生长因子受体(c-kit)mRNA［2］的表达变化，探讨“泻剂结肠”的发生机制。

1 材料与方法

1.1 实验动物与分组 健康清洁级雄性Wistar大鼠20只，3～4周龄，体质量50～80 g，由斯贝福(北京)实验动物科技有限公司提供［许可证号SCXK (京)2011-0004］，在室温18～23℃、相对湿度50%～70%的清洁安静环境中常规饲养。将20只大鼠随机分为实验组与对照组，各10只。

1.2 “泻剂结肠”大鼠模型的制作 实验组给予大黄酸粉悬液灌胃制备“泻剂结肠”大鼠模型［3，4］。造模过程分3个循环，约115 d完成。第1个循环(约35 d)给药剂量为240 mg/(kg·d)，灌2 d停1 d，约半数大鼠出现稀便，维持此剂量直至80%的大鼠稀便消失开始下一循环;第2个循环(约35 d)给药剂量同上，灌5 d停2 d，直至80%的大鼠稀便消失;第3个循环(约45 d)给药剂量为320 mg/(kg·d)，灌5 d停2 d，直至80%大鼠稀便消失，造模完成。对照组给予10 mL/(kg·d)生理盐水灌胃。依据Bristol大便性状分型［5］，每日10:00观察大鼠粪便性状。实验组大鼠停止大黄酸粉悬液灌胃7 d后，禁食、不禁水24 h，经口灌入100 g/L活性炭悬液2 mL，40 min后颈椎脱臼法处死。对照组于同一时间处死大鼠。立即剖腹，结扎幽门和直肠末端，分离肠系膜，无张力情况下测量肠道全长及活性炭末推进长度。活性炭末推进率(%)=(炭末前端与幽门的距离/肠道全长)×100%。

1.3 胃窦、小肠、结肠组织中c-kit mRNA的检测采用real-time PCR法。留取两组大鼠胃窦部胃壁全层及十二指肠远端、结肠组织，放入冻存管保存于－80℃冰箱。采用TRIzol-A+Reagent试剂提取总RNA，合成cDNA。c-kit mRNA上游引物序列为5'-CTGATCCCCTGAAAAGGCCAACA-3'，下游引物序列为5'-ACAGAATGGTCCACCACCACG-3';内参β-actin上游引物序列为 5'-CCCATCTATGAGGGTTACGC-3'，下游引物序列为 5'-TTTAATGTCACGCACGATTTC-3'。PCR反应条件:95℃预变性1 min，95℃变性15 s，60℃退火15 s，72℃延伸45 s，共40个循环，每个样品重复测3次。记录每个样品的Ct值，以2－△△Ct进行相对量分析。

1.4 统计学方法 采用SPSS17.0软件。计量资料以s表示，采用t检验。P＜0.05为差异有统计学意义。

2 结果

实验组大鼠大便性状较对照组明显变硬。实验组肠道全长、活性炭末推进长度、活性炭末推进率分别为(135.66±4.33)cm、(53.23±6.63)cm、39.24%±4.28%，对照组分别为(133.07±6.27) cm、(82.35±6.58)cm、61.84%±3.05%，两组活性炭末推进率相比，P＜0.05。实验组成功制作了“泻剂结肠”模型。

实验组大鼠胃窦、小肠、结肠组织中c-kit mRNA相对表达量分别为0.61±0.08、0.37±0.02、0.32 ±0.03，对照组分别为0.67±0.03、0.90±0.05、1.01±0.09，两组小肠及结肠组织中c-kit mRNA相对表达量相比，P均＜0.05。

3 讨论

“泻剂结肠”是STC的一种主要类型，涉及全胃肠道动力紊乱，尤其以结肠传输减慢为主［6，7］。泻剂的长期使用使肠神经系统紊乱及功能失调，导致结肠动力受损［8］，同时患者对泻剂的反应性下降，便秘症状逐渐加重，由腹泻最终形成泻剂依赖性便秘。大黄、番泻叶等刺激性泻剂可诱导“泻剂结肠”形成。大黄酸是从大黄中提取的单体物质，本研究实验组采用大黄酸造模，避免了大黄在制备“泻剂结肠”模型过程中存在稀便情况不稳定、使用剂量不统一等问题［4］。我们发现，实验组大鼠大便性状干硬，活性炭末推进率明显降低，肠道传输时间明显延长，表明“泻剂结肠”大鼠模型制备成功。

近几年ICC在胃肠道运动紊乱性疾病中的作用成为国内外研究的热点。ICC作为一类特殊的间质细胞，广泛分布于整个胃肠道。ICC不仅是胃肠道运动的起搏细胞，可通过产生慢波，促进胃肠道收缩，加速胃肠道运动;同时ICC还可调节或介导肠神经信号向平滑肌细胞传递，参加电流的传导。ICC的数量、分布、结构及功能异常被认为是STC发病的关键因素［9，10］。c-kit是一种原癌基因，编码Ⅲ型酪氨酸蛋白激酶生长因子受体，通过与干细胞因子(SCF)结合使信号途径激活，在ICC发育、存活、增殖、分化及迁移等方面发挥重要作用［11，12］。研究［13］表明，敲除大鼠小肠c-kit基因后，ICC将不能产生慢波，胃肠运动功能发生紊乱，其可作为ICC的特异性标志物。Adachi等［14］发现c-kit mRNA表达下调可导致STC患者乙状结肠ICC数量减少，为STC的重要发病机制。霍明东等［15］推测，长期应用刺激性泻剂可使c-kit mRNA在结肠中的表达下调，进而使ICC网状结构破环，最终导致“泻剂结肠”的形成。

“泻剂结肠”患者常有不同程度的上腹部饱胀不适、早饱、反酸、嗳气、胃排空障碍等上消化道症状，甚至有些患者在切除部分结肠后仍可伴有上述症状，我们推测“泻剂结肠”可能涉及全胃肠道运动功能失调，而不单局限于结肠。因此，我们对两组大鼠全胃肠道中c-kit mRNA的表达情况进行观察，结果发现实验组小肠及结肠组织中c-kit mRNA表达降低，提示c-kit mRNA的低表达与“泻剂结肠”的形成有关，但小肠组织c-kit mRNA表达降低为原发性还是继发于结肠功能障碍需要深入研究。胃节律性运动的起搏点位于胃窦，且ICC在胃窦的分布多于胃底，因此我们留取胃窦组织进行实验。研究结果显示，实验组胃窦组织中c-kit mRNA的表达与对照组差异无统计学意义，推测可能由于胃的正常功能受肠神经系统、ICC、平滑肌共同调节，ICC的功能并不能全面反映胃功能，“泻剂结肠”患者上消化道症状可能与ICC异常表达无明确相关性，具体原因尚需进一步探索。

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