Toll样受体4与脑缺血再灌注损伤的关系研究进展

杨楠，唐金荣

(1南京医科大学第一临床医学院，南京210000；2南京医科大学第一附属医院)

Toll样受体4与脑缺血再灌注损伤的关系研究进展

杨楠1，唐金荣2

(1南京医科大学第一临床医学院，南京210000；2南京医科大学第一附属医院)

Toll样受体4(TLR4)是先天性免疫系统的一种跨膜受体蛋白，属于Ⅰ型跨膜糖蛋白受体，可以识别外源性病原相关分子模式和内源性损伤相关分子模式，并启动免疫应答。在脑缺血再灌注过程中，小胶质细胞、星形胶质细胞及损伤的神经元等产生并释放大量的低分子透明质酸、热休克蛋白等物质，作为内源性配体激活TLR4介导的信号通路，产生炎性级联反应，在脑缺血再灌注损伤的发生、发展过程中发挥关键作用。

脑缺血；缺血再灌注损伤；Toll样受体4；信号转导

脑缺血再灌注损伤(CIRI)是指在脑缺血的基础上恢复血液灌注后，脑组织损伤反而加重甚至发生不可逆损伤的现象。Toll样受体4(TLR4)是先天性免疫系统的一种跨膜受体蛋白，可以识别外源性病原相关分子模式和内源性损伤相关分子模式，并启动免疫应答。本文就近年来TLR4与CIRI关系的研究进展作一综述。

1 TLR4结构、分布和配体

TLR4属于I型跨膜糖蛋白受体，由胞外的配体识别结构域、跨膜区和胞内的信号转导结构域3个部分组成[1]。胞外区参与识别外源性病原相关分子模式(PAMPs)和内源性损伤相关分子模式(DAMPs)，胞内区高度保守，是负责向下游传递信号的核心元件[2,3]。

TLR4几乎分布于人类所有的细胞系，但主要表达于各种参与防御功能的细胞，如淋巴细胞、粒细胞、单核巨噬细胞等[4]。在人类脑组织中，神经元、星形胶质细胞、少突胶质细胞和小胶质细胞中均有TLR4表达，尤以小胶质细胞和星形胶质细胞表达较多[5]。正常鼠类动物的脑组织中也有少量TLR4表达，且以小胶质细胞为主。

TLR4不仅可以特异性识别外源性PAMPs，如革兰氏阴性细菌的脂多糖、真菌的多聚糖、呼吸道合胞病毒的F蛋白等[6]；还可以特异性识别内源性DAMPs，这类配体在正常生理条件下不暴露于机体免疫系统，而是由组织和细胞发生损伤或应激时释放，包括热休克蛋白、高迁移率族蛋白1(HMGB1)、透明质酸、纤维蛋白原等[7]。

2 TLR4介导的信号转导通路

TLR4与配体结合活化后将其信号传递给髓样分化因子88(MyD88)或含TIR结构域诱导干扰素β接头蛋白(TRIF)而发挥信号级联效应，这两条通路分别被命名为MyD88依赖性信号转导通路和TRIF依赖性信号转导通路[8]。

2.1 MyD88依赖性信号转导通路 TLR4活化后通过激活MyD88而将信号传递给IL-1受体相关激酶(IRAKs)家族成员。IRAKs活化后与肿瘤坏死因子受体相关因子6(TRAF-6)结合形成复合物，后者活化后再通过TAK-1结合蛋白(TAB)诱导激活转化生长因子β激酶1(TAK-1)，继而激活NF-κB诱导激酶(NIK)，使NF-κB抑制物激酶(IKK)复合体磷酸化而活化[9]。活化的IKK复合体(IKKα和IKKβ)诱导IκB泛素化而降解，使NF-κB游离活化并易位至细胞核与炎性调节基因的启动子结合，促进TNF-α、IL-1、IL-6、IL-8等多种炎性细胞因子的转录与合成，启动炎性级联反应[10]。

此外，TAK-l还可以诱导MAPK激酶(MKK)家族发生磷酸化，继而激活丝裂原活化蛋白激酶(MAPK)家族，包括Jun氨基末端激酶(JNK)、p38和细胞外信号调节激酶(ERK)，最终激活转录激活因子蛋白1(AP-1)，从而参与细胞的增殖、转化与凋亡[11]。

2.2 TRIF依赖性信号转导通路 在TRIF依赖性信号转导通路中，活化的TLR4通过激活TRIF继而将信号传递给下游的TRAF3或TRAF6而激活两条不同的信号通路，产生不同的转录产物[12]。

TRAF3活化后与TRAF家族相关NF-κB激活剂(TANK)、TANK结合激酶1(TBK1)、IκB激酶ε(IKKε)结合形成复合物，使TBK-1和IKKε磷酸化而活化。活化的TBK-1和IKKε作为干扰素调节因子3(IRF-3)的激酶激活IRF-3。IRF-3活化后形成二聚体进入细胞核，结合于IFN-β基因上游的干扰素敏感反应元件(ISRE)，使IFN-β基因活化表达。

TRAF6被激活后，其后继通路与MyD88依赖性信号通路基本相同，即活化的TRAF6继而激活TAK-1，引起IKK复合体介导的NF-κB以及MAPK信号通路的激活。

3 TLR4与CIRI发生、发展的关系

在脑缺血再灌注的过程中，小胶质细胞、星形胶质细胞、血管内皮细胞、损伤的神经元等产生并释放大量的低分子透明质酸、纤维蛋白原、热休克蛋白60、热休克蛋白70、硫酸肝素等物质，这些分子作为TLR4的内源性配体激活TLR4介导的信号转导通路，最终产生大量的炎性细胞因子、趋化因子、细胞间黏附分子以及一些酶类物质等，启动炎性级联反应，在CIRI的发生、发展过程中发挥重要作用[13]。

Hyakkoku等[14]应用TLR3、TLR4、TLR9基因敲除小鼠与野生型小鼠进行对照研究发现，在脑缺血2 h再灌注24 h，只有TLR4基因敲除小鼠的脑梗死体积明显小于野生型小鼠，推测TLR4可能在CIRI中发挥重要作用。在CIRI的过程中，内皮细胞等释放大量的EDA+纤维蛋白原(EDA+-FN)。Khan等[15]发现，EDA+/+小鼠的脑梗死体积、神经功能缺损程度及COX2、NF-κB、TNFα、IL-1β、IL-6表达水平均显著高于野生型小鼠；而在接受TLR4抑制剂处理的EDA+/+小鼠，上述指标则明显下降；提示EDA+-FN可能通过TLR4介导的NF-κB信号通路参与CIRI。Yang等[16]分别通过临床、细胞和动物实验发现，急性脑梗死患者体内HMGB1水平显著升高且与神经损伤程度相关；重组人HMGB1(rHMGB1)可以刺激小胶质细胞活化，并通过NF-κB通路产生NO，上调COX2、IL-1α、IL-1β、TNFα的转录和表达，而TLR4-/-小胶质细胞对rHMGB1无反应；向脑缺血再灌注小鼠模型侧脑室注射rHMGB1，TLR4+/+小鼠的神经功能损害明显加重，而TLR4-/-小鼠则无明显变化；由此证实，HMGB1/TLR4信号通路通过诱导小胶质细胞活化在CIRI的炎症机制中发挥重要作用。Gao等[17]发现，在脑缺血再灌注组小鼠的脑组织内，TLR4、MyD88及其下游TNF-α的表达水平显著升高；而在TLR4抗体预处理组，MyD88、NF-κB及其下游炎性细胞因子的表达水平则显著下降；提示TLR4-MyD88依赖性信号转导通路在脑缺血再灌注时被激活，并在CIRI的发展过程中发挥重要作用。Hua等[18]研究发现，TLR4基因敲除小鼠的脑梗死体积、神经元凋亡数量、NF-κB激活程度均显著低于野生型小鼠。Weinstein等[19]在缺氧—缺糖条件下培养小鼠小胶质细胞(BV-2)，体外模拟CIRI，结果显示TLR4和NF-κB mRNA表达量均显著上调，其下游炎性细胞因子水平也显著增加。

上述研究都表明，TLR4在CIRI的病理生理过程中发挥重要作用，缺血再灌注可以激活TLR4表达，TLR4信号通路激活和TLR4表达上调可以引起并加重局部脑损伤，而TLR4功能缺失则可产生神经保护效应。

4 TLR4通路的炎性细胞因子与CIRI发生、发展的关系

在脑缺血再灌注过程中，内源性配体通过TLR4信号通路激活NF-κB，最终诱导促炎因子、趋化因子、黏附分子等物质的大量表达形成炎症瀑布，是加重脑损伤的中心环节。在NF-κB下游的炎症因子中，尤以IL-1β和TNF-α的作用突出和研究最多。NF-κB活化可以增强IL-1β和TNF-α的转录水平，而IL-1β、TNF-α又是NF-κB的激活剂，这种正反馈效应可以导致NF-κB在细胞内持续活化，是导致神经元发生不可逆损伤的关键环节。

IL-1β是一种免疫源性细胞因子，具有强烈的趋化作用。脑缺血时IL-1β含量增加，可诱导中性粒细胞和巨噬细胞向损伤区域迁移和浸润，并释放多种炎性介质，加重炎症反应。IL-1β还可以上调细胞间黏附分子1(ICAM-1)的表达，增强白细胞与内皮细胞间黏附，诱导内皮细胞产生促凝血因子，促进血管内血栓形成。另外，IL-1β还可导致兴奋性氨基酸、自由基、NO、蛋白水解酶等释放增加，产生神经毒性，诱导神经元凋亡。

在中枢神经系统内，神经元、星形胶质细胞和小胶质细胞是TNF-α的主要来源。在正常情况下，TNF-α的少量表达具有神经修复作用，而在脑缺血再灌注的过程中，TNF-α表达显著增加可加重脑损伤。与IL-1相似，TNF-α也可刺激ICAM-1表达增加和诱导兴奋性氨基酸、氧自由基等神经毒性物质产生。另外，TNF-α可激活血管内皮细胞，使血管通透性增加，并诱导内皮细胞产生和释放IL-1及组织因子，同时抑制抗凝及纤溶系统的活性，与IL-1协同作用，促进血栓的形成。TNF-α还可促使星形胶质细胞和小胶质细胞中IL-1、IL-6等炎症因子，以及具有细胞毒性的诱导型一氧化氮合酶(iNOS)表达增加，产生协同促炎作用，加重神经细胞损伤。

5 TLR4与CIRI治疗的关系

近几年来，随着TLR4信号通路在CIRI中的研究深入，以TLR4为靶点的治疗也取得了突破性的进展。大量的动物实验表明，多种化学药物通过作用于TLR4及其上游或下游的信号分子在CIRI过程中发挥脑保护作用，如：棓酸丙酯可以抑制热休克蛋白70及其介导的TLR4通路中NF-κB、COX-2和TNF-α的表达[20]；藁苯内酯通过抑制髓过氧化物酶-6介导的TLR4信号传导通路发挥神经保护作用[21]；木犀草素通过下调TLR4、TLR5、NF-κB、p38MARK表达，上调ERK表达，发挥缺血后脑保护作用[22]；胡黄连苷Ⅱ、银杏内酯B和黄芩苷等通过抑制TLR4、NF-κB及下游COX-2、TNF-α、IL-6、IL-1β表达减轻CIRI。研究证明，电针刺激曲池和足三里可以抑制TLR4-NF-κB信号通路及其下游炎性细胞因子TNF-α、IL-6、IL-1β表达，进而发挥神经保护和抗炎作用。大鼠脑缺血前3周或再灌注第5天进行跑步机训练，通过抑制脑组织中TLR2、TLR4及其下游分子MyD88、NF-κB表达，促进神经功能恢复。

综上所述，抑制TLR4表达及其上下游信号通路转导能有效保护CIRI。但是，这些研究主要局限于基础研究，真正能应用于临床的成果尚少，仍需要进一步研究以筛选出一种靶向阻断TLR4并可能在今后的临床实践中应用的药物。另外，由于TLR4在机体正常免疫系统中也发挥重要作用，但其功能及机制还不完全清楚，以TLR4为靶点的治疗是否会对正常免疫系统造成不良影响尚需进一步研究证实。

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唐金荣，E-mail: zdgaoyang@medmail.com.cn

10.3969/j.issn.1002-266X.2015.12.043

R743

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1002-266X(2015)12-0103-03

2014-07-01)