蛋白质转导结构域的研究概况

湖南食品药品职业学院（410208）赖利平 潘伟男 邓水秀 郑慧芝

湖南省长沙市雨花区圭塘街道长重社区卫生服务站（410014）刘瑛

细胞膜脂质双分子层具有非渗透特性，它阻碍了一些多肽、蛋白质、核酸等生物活性物质及高分子复合物进入细胞，这些天然屏障的存在也影响了一些生物学机制的研究和某些疾病的防治。近年来，研究发现的一些能携带生物活性物质并有效穿过多种哺乳动物细胞膜的小分子阳离子多肽——蛋白质转导结构域（protein transduction domain，PTD），成功开启了生物活性大分子向细胞内转运的大门。

1988 年Green和Frankel等首次报道了人类免疫缺陷病毒（HIV）的转录反式激活蛋白（TAT）可跨膜转导入哺乳动物的细胞内，并发现进入细胞的TAT蛋白定位于细胞核，与启动子结合后，反式激活HIV病毒转录。1994年Fawell等报道了TAT与β-半乳糖苷酶、辣根过氧化物酶、RNA酶、蛋白毒素等异源蛋白质共价结合，可共同转导至细胞内，并证实TAT多肽是一种潜在的细胞穿膜转导剂。进一步研究发现，TAT蛋白中存在一个富含碱性氨基酸的、带正电荷的多肽片段（第48～60位氨基酸）是TAT穿膜的功能序列，此多肽与蛋白质转导密切相关，故称为PTD或细胞穿膜肽（cell penetrating peptide，CPP）。随着研究的不断深入，又发现了一些高效PTD，如黑腹果蝇触足肽（Antp43-58）、单纯疱疹Ⅰ型病毒转录调节蛋白（HSV-1 VP22）及人工合成的多聚精氨酸、PTD-3、PTD-5和CADY等[1][2]。这些PTD大多是病毒蛋白的核定位序列，能穿透生物膜，具有天然的DNA亲和力。

与其他生物大分子的转运方式相比，PTD转导作用具有许多独特之处[3]：①PTD不仅可以转导酶、转录因子、单克隆抗体等多肽和蛋白质，也可将与其偶联的小分子有机化合物、寡核苷酸、DNA、噬菌体、脂质体和纳米级铁珠等多种大小不同的其他物质转导入细胞或穿过血脑屏障，且大部分的多肽和蛋白质导入细胞后仍保持其生物活性。②PTD几乎能将介导的外源分子导入所有的哺乳动物细胞，甚至包括对DNA转染和逆转录病毒感染都不起作用的破骨细胞与外周血单核细胞。③PTD转导以浓度依赖性方式进行，转导效率高，几乎可以达到100%，并且转导作用迅速，在培养基中加入PTD后5min就可在细胞内检测到，甚至还能达到细胞最大浓度。④PTD转导对细胞几乎没有毒性，不破坏细胞膜和血脑屏障，不被肝和脾的巨噬细胞吞噬，也不被溶酶体降解。基于上述特点，PTD在基础研究和应用研究中显示出明显优势和广阔前景。

PTD均为带正电荷的、长短不等的小分子多肽，可携带多种生物活性物质入膜，其转导穿膜机制存在四种理论学说：①非经典转导学说。研究发现PTD穿膜过程与受体介导无关，且使用线粒体呼吸链代谢抑制剂（叠氮钠、鱼藤酮等）后，PTD转导不受影响，提示此作用不依赖能量，为非主动转运。另有研究报道，PTD转导在4℃时的转导效率与37℃时基本相同，而低温时正常的胞吞作用已经失活，提示PTD转导不以经典的胞吞形式进行。②非经典胞吞作用学说。研究发现PTD转导作用因加入一些细胞内吞作用抑制剂（秋水仙素、紫杉醇、氯喹等）而减弱，故认为这种不同于经典胞吞作用的途径也存在于PTD转导过程中。③内吞摄取机制学说。研究表明在细胞内，PTD及其复合物存在于内吞体中，可能是通过细胞膜快速静电作用摄取PTD及其复合物，再内吞到细胞中。④细胞摄取机制学说。研究推测PTD的穿膜机制可能是阳离子多肽与生物膜上的阴离子物质（糖胺聚糖等）形成中性复合物，进一步激活了细胞摄取机制[4]。

PTD通常由10～16个氨基酸组成，共同结构特点是富含精氨酸残基，其氨基酸序列即一级结构对PTD穿膜功能非常重要，除此之外，它们在序列和结构上很少具有相似性。研究发现，PTD的跨膜转导过程可分为三个步骤：①PTD通过静电相互作用结合在细胞膜表面，PTD氨基酸序列上的正电荷和包膜表面的负电荷相互吸引，再通过静电作用促使PTD结合到包膜表面。②在第一步的静电相互作用下，PTD携带偶联的活性物质以前述的四种可能机制转导入膜，多聚精氨酸和TAT中精氨酸的胍基有助于PTD跨膜转导。③PTD导入的活性物质在细胞内发挥生物学效应。随后PTD在细胞内代谢分解，并可在细胞周围介质中检测到它们的降解产物。

蛋白质转导建立了一条直接、快速、有效的新型细胞转运系统。PTD的应用打破了蛋白质常规只能通过细胞表面受体和信号转导途径，将其所携带的生物信息传递至细胞内的经典规律，开辟了蛋白质治疗的新领域和新路径。蛋白质转导技术也必将成为蛋白质功能研究和细胞内药物运输的有力工具，将在疾病防治、基因治疗和新药研发等方面发挥更重要的作用。