实时荧光定量PCR检测TB-DNA与痰涂片在肺结核诊断中的比较研究

广东省梅州市人民医院（514031）郑志远

肺结核是结核分歧杆菌感染引发的肺部传染性疾病，多通过呼吸系统传播，是一项严峻的全球性卫生问题，发病人数呈增长趋势。结核菌感染后不一定发病，但当机体抵抗力下降时则疾病发作[1][2]。由于结核菌株的不断进化，其耐药性增强，增加了治疗难度，因此及时的检测诊断才能够有效地避免肺结核的扩展趋势。临床常用的病原学检测手段为痰涂片，虽然方便快捷，但其检测敏感性差，并不能成为结核病诊断的有效辅助手段，结核菌分离培养目前是肺结核疾病诊断的金标准[3]。肺结核病人中痰菌阴性表达的比例较大，因此对于高敏感性检测手段的选择尤为重要。本文采用实时荧光定量PCR检测TBDNA的方法诊断肺结核进行研究，现将研究结果报道如下。

1 资料与方法

1.1 临床资料 选取本院2013年3月～2014年9月期间确诊为肺结核患者106例，其中男性56例，女性50例，年龄：37～55岁，平均年龄（45.33±7.19）岁。选取同期非结核性肺部疾病患者152例，其中男性79例，女性73例，年龄：36～51岁，平均年龄（43.20±7.24）岁。采用实时荧光定量PCR检测TB-DNA及痰涂片两种方法对入组患者进行检测，比较两种检测方法与金标准的一致性，计算并比较两种检测方法的灵敏性和特异性。确诊组患者均为根据肺结核诊断标准（WS288-2008）的金标准而确诊的病例[4]，对照组患者均为非结核性肺部疾病患者，包括肺炎83例，肺部肿瘤39例，慢阻肺18例，肺不张12例。两组患者其它基本资料无差异（P＞0.05）。

1.2 方法

1.2.1 仪器及试剂 本研究中使用的PCR检测仪为Roche LightCycler，试剂盒由中山大学达安基因股份有限公司提供，该试剂亦为广州达安生产的结核分枝杆菌核酸检验试剂盒（PCR—荧光法）。

1.2.2 实时荧光定量检测TB-DNA 采集外周血，肝素抗凝，2微升样品加入专用毛细管中，4000r/min离心3分钟，插入圆形卡盘倒置20s。使用中山大学达安基因公司提供的试剂盒提取DNA，使用PCR仪器进行扩增，设置循环参数为：93度→2分钟变性，然后按93度5秒→57度45秒，做40个循环，最后置37度延伸1秒（见附表1）。敏感性、特异性的评价标准：荧光定量PCR扩增曲线规则，呈对数增长，Ct值≤36 即可判定为阳性; 如扩增曲线不规则或Ct值＞40，报告为阴性; 如Ct值在36～40，且扩增曲线呈对数增长，样本重复测定，如Ct值仍在36～40之间报告为阴性。

附表1 循环参数

附表2 实时荧光定量PCR检测结果与金标准确诊比较

附表3 痰涂片检测结果与金标准确诊比较

1.2.3 痰涂片方法 收集清晨深咳浓痰，涂片后进行抗酸杆菌染色，高倍显微镜下计数，100个高倍视野下菌落≥3个为阳性。

1.2.4 统计学方法 应用SPSS19.0软件分析，计数资料采用百分比表示，采用Kappa一致性检验，检验两种方法与金标准的一致性，Kappa值取值为0～1，越接近1，一致性越优，在这里，越接近1，检出效果越好。其中，Kappa≥0.75两者一致性较好；0.75＞Kappa≥0.6两者一致性一般；0.6＞Kappa≥0.4，两者一致性可接受；Kappa＜0.4，两者一致性较差。灵敏度计算：灵敏度=真阳性例数/(真阳性例数+假阴性例数)；特异度计算：特异度=真阴性例数/（真阴性例数+假阳性例数）。

2 结果

2.1 实时荧光定量PCR检测结果与金标准确诊比较 在样本总体中，通过实时荧光定量PCR检测出阳性结果例数81例，阴性例数177例，其中真阳性例数为77例，真阴性例数为148例，其中假阳性例数为4例，假阴性例数为29例。实时荧光定量PCR检测：灵敏度=真阳性例数/(真阳性例数+假阴性例数)=77/（77+29）=72.64%；特异度计算：特异度=真阴性例数/（真阴性例数+假阳性例数）=148/(148+4)=97.37%，通过Kappa一致性检验发现：Kappa=0.726，实时荧光定量PCR检测结果与金标准确诊比较两者一致性一般。具体见附表2。

2.2 痰涂片检测结果与金标准确诊比较 在样本总体中，通过痰涂片检测结果出阳性例数43例，阴性例数215例，其中真阳性例数为31例，真阴性例数为140例，其中假阳性例数为12例，假阴性例数为75例。痰涂片检测：灵敏度=真阳性例数/(真阳性例数+假阴性例数)=31/(31+75)=29.25%；特异度计算：特异度=真阴性例数/(真阴性例数+假阳性例数)=140/(140+12)=92.10%，通过Kappa一致性检验发现：Kappa=0.235，痰涂片检测结果与金标准确诊比较两者一致性较差。具体见附表3。

通过比较两者与金标准的一致性检验，发现实时荧光定量PCR检测结果与金标准确诊比较两者一致性一般，痰涂片法检验结果一致性较差，实时荧光定量PCR检测方法效果更优。

3 讨论

肺结核的扩展趋势逐年增长，对于该病的早期检测诊断非常重要。临床检测手段较多，但是在结核菌感染的最初阶段检测结果并不能令人满意。痰涂片操作简单，但因操作者的主观性及涂片、染色过程中的误差而降低了检测的敏感性[5][6]。痰培养通过专门的培养皿，在合适的外界环境下，进行菌群培养，应用了致病菌应高于污染菌的原理，是目前临床中的金标准。但其培养周期较长，假阴、假阳性结果较多，且对于其他组织器官结核性疾病的检测较为繁琐。PPD试验应用也比较广泛，其通过致病菌导致机体产生致敏淋巴细胞，在再次接触致病菌时会出现扁他反应，从而在皮肤表面出现表达。其操作快捷，但其敏感性、特异性都不够理想，主要是由于免疫系统及交叉反应产生误差，仅能作为一种临床诊断的辅助手段[7][8]。

常规PCR的操作检测血清DNA过程不具有高敏感、高特异的效果。实时荧光定量PCR检测TB-DNA方法是通过荧光化学物质检测PCR循环产物，通过内参或外参对样品特定DNA序列进行定量分析。其操作过程更为快捷且敏感性、特异性较高。本研究中通过对肺结核患者的结核杆菌检测发现，实时荧光定量PCR检测TB-DNA方法在检测肺结核患者时灵敏度较高，达到72.64%，明显优于痰涂片方法[9][10]。在对非结核性肺疾病患者的研究中发现，实时荧光定量PCR检测TB-DNA方法与痰涂片的特异性均较高并无明显差别。痰涂片敏感性较低主要因为痰液中结核分歧杆菌的分布不均匀导致观察数量受限，虽然实时荧光定量PCR检测TB-DNA灵敏度和特异度较痰涂片检测更高，但与金标准比较，一致性仅为一般，仍有漏诊病例出现，灵敏度仍不高，假阴性例数较多，因此该手段作为诊断肺结核的辅助手段效果优于痰涂片，但仍然不能作为肺结核确诊的依据。曹冉冉[11]等对非典型结核患者纤支液研究中发现，使用实时荧光定量PCR检测其灌洗液中TB-DNA阳性检出率8.54%，痰涂片阳性检出率为2.28%，实时荧光定量PCR定量检测TB-DNA能够明显提高结核杆菌的检出率。贺松等相关研究中发现，TB-DNA在肺结核的检测敏感性为71.54%，痰涂片为26.15%，TB-DNA检测法有明显优势，但T-SPOT.TB检测敏感性达到92.31%，明显优于前两种方法，亦与本文的相关报道基本一致。

综上，本研究中可以证明实时荧光定量PCR检测TB-DNA在肺结核疾病诊断中具有良好的辅助作用，其灵敏度和特异度，以及与金标准对比的一致性，均明显优于痰涂片检测方法，但仍然有部分的漏诊例数，与金标准对比，一致性仅一般，未达kappa值大于0.75以上，并不能作为肺结核疾病的确诊依据。但是在肺结核患者早期的检测、预防上还是具有相当高的指导价值，应当大力推广使用，以期达到肺结核疾病的早预防、早诊断，在源头控制住结核性疾病的传播。